检化员微生物培训

无菌医疗器械检(化)验员培训微生物实验指导苏州大学卫生与环境技术研究所检测中心方菁嶷邹婷徐琳刘春丽微生物学实验室规则•1.进实验室必须穿实验服，与实验无关的物品切勿放在污染的实验台上。•2.实验室内不准吸烟、吃东西。•3.实验室用过的带有微生物的吸管、玻片等应分别放在指定的消毒筒内。待消毒或废弃物品必须放在指定的地点。•4.如有微生物污染桌面、地而、书和衣物等，应立即报告老师，并用0.1％新洁而灭溶液处理半小时，或其他方法处理后洗净。•5.如有活菌碰到手上应将手浸泡在0.1％新洁而灭溶液5～10分钟，然后用自来水冲洗。•6.实验过程中要爱护器材，严格按操作规程实验，并遵守无菌操作。•7.实验完毕，桌面应整理清洁，不可将火柴梗、擦镜纸投入水槽内、用过的物品归还原处（如接种环、染色液、擦镜纸、香柏油、火柴等），实验室打扫干净，关好水、电和窗。•8.实验材料不得携带出实验室以免造成污染。•9.用消毒液浸泡双手，再用自来水冲洗干净，脱去实验服，方得离开实验室。一、人员资质及培训要求•从事医疗器械微生物检验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认它们可以承担某一检验前，他们不能独立从事该项微生物检验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必须的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别试验人员的继续教育计划。•检验人员必须熟悉相关监测方法、程序、检验目的和结果评价。微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符，如：管理技能、实验室安全、检验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。一、人员资质及培训要求二、实验室环境控制•【原则】实验室布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止检验过程对环境和人员造成危害。通常，实验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应根据试验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动，将交叉污染的风险降低到最低。•一般情况下，医疗器械微生物检验的实验室应具有开展无菌检查、微生物限度检查等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并为上述检验配备相应的细菌（真菌）等实验室、培养室、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和储藏区、标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。二、实验室环境控制•【要求】1、无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。用于无菌检查和微生物限度检查的洁净操作室应配有属于“人流净化”的更衣室及属于“物流净化”的缓冲间或传递窗（柜），使进入洁净操作室的实验人员和实验物品分别经适当净化后进入实验操作间。无菌室分无菌操作室和缓冲间。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置。操作室或工作台应保持正压。应在压差十分重要的相邻级别区之间安装压差表。二、实验室环境控制【要求】•2、微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。因此，微生物限度检查宜在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行；限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间，并定期作环境监测。二、实验室环境控制【要求】•3、菌种处理、微生物鉴别和阳性对照室•菌种的处理包括的内容比较多，如菌种的传代、保藏、制备以及培养基促生长实验、阳性对照、微生物方法验证、消毒剂和防腐剂的效力测定和对环境中分离菌的鉴别等，这些实验过程中都在处理活的微生物，处理不当会造成实验室环境污染，影响其他实验结果，因此，该室必须与其他实验室严格分开；必要时，应按实验室性质的需要保持对相邻实验室的相对压差；需采取必要的消毒方式确保实验室洁净条件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以净化层流台作为局部100级的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的与活毒菌种相关的活动都应在层流台或生物安全柜中进行。每次实验结束后要对层流台或生物安全柜及整个实验室环境进行消毒。所有与菌种相关的实验废物均应经过灭菌处理后方可丢弃。二、实验室环境控制【要求】•4、培养室及其他功能间培养室用于放置培养细菌和真菌的培养箱。准备区即试液及培养基配制/灭菌区域、实验器皿洗涤、烘干室、灭菌室、实验用品及易耗品储藏室等没有特殊要求的功能间，可为一般清洁环境。微生物环境控制相关标准•GB/T16292:2010，医药工业洁净室(区)悬浮粒子测试方法•GB/T16293:2010，医药工业洁净室(区)浮游菌测试方法•GB/T16294:2010，医药工业洁净室(区)沉降菌测试方法•GB50073-2001洁净厂房设计规范•ISO14644-1:1999洁净室及相关受控环境第1部分：空气洁净度等级划分•ISO14644-4:1999洁净室及相关受控环境第4部分：设计、施工、运行•ISO14644-7:1999洁净室及相关受控环境第7部分：分离的设备微生物实验控制1：环境控制无菌室环境控制设备微粒计数仪无菌室环境控制设备浮游菌采样仪无菌室环境控制设备无菌室环境控制设备洁净室沉降菌测试方法•1.测试时间•1.1对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。•1.2对非单向流，如10000级、100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。•2.采样方法•将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。•2.2.培养•全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。洁净室沉降菌测试方法•3.菌落计数•用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。•若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。•4.注意事项•4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。•4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。•4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。•4.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。•4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。洁净室沉降菌测试方法•5.测试规则•5.1.测试状态•5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。•5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。•5.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。•5.2.测试人员•5.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。•5.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于二人。最少采样点数目面积洁净度级别10010000100000102～322≥10～＜20422≥20～＜40822≥40～＜1001642≥100～＜20040103≥200～＜40080206≥400～＜10001604013≥1000～＜200040010032200080020063注：表中的面积，对于单向流洁净室.指的是送风面积；对非单向流洁净室，指的是房间面积同时满足最少平皿数洁净度级别所需Φ90mm培养皿数（以沉降0.5h计）100级1410000级2100OOO级2采样点的布置•采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。•a）工作区采样点的位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。•b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。•采样点位置的详细规则见附录B（标准的附录）。采样点布置洁净度级别沉降菌浮游菌尘粒的最大允许数/m3个/（Φ90mm）0.5h）活微生物数/m3≥0.5µm≥5µm100≤1≤5≤3500－10000≤3≤100≤350000≤2000环境检测参照标准微生物实验室管理超净工作台100级微生物实验室管理严格区分污染区及清洁区相关标准•GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准•GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准•GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法和标准三、灭菌控制•微生物实验使用的试剂、器材等常需用湿热灭菌法。湿热灭菌的温度和时间需验证，必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL≤10-6。灭菌程序经验证合格后方可使用。定期进行BD实验、真空泄漏测试、温度参数测试（空载热分布、定载热穿透、满载热穿透）、压力改变速率测试（GB8599-2008大型蒸汽灭菌器技术要求），同时以生物指示剂验证灭菌效果,必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL小于百万分之一。三、灭菌控制•所有器具应采用可靠方法灭菌•置压力蒸汽灭菌器内121℃30min或•置电热干燥箱内180℃2h。湿热灭菌仪器圆型压力蒸汽灭菌器全自动压力蒸汽灭菌器干热灭菌仪器烤箱烤箱电热鼓风干燥箱湿热灭菌控制相关标准•GB18281.3-2000医疗保健产品灭菌生物指示物第3部分:湿热灭菌用生物指示物•ISO11138-3-2006医疗保健产品灭菌.生物指示物.第3部分:湿热灭菌用生物指示剂四、培养基管理•1、培养基的制备•2、培养基的贮藏•3、培养基的质量控制实验四、培养基管理•灵敏度检查（中国药典2010）•无菌检查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）五、无菌操作•定义：是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。•无菌操作技术主要包括两方面：创造无菌的培养环境及在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入。创造无菌的培养环境包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。微生物实验前准备•微生物实验控制1：人员管理•微生物实验控制2：环境控制•微生物实验控制3：灭菌控制•微生物实验控制4：培养基管理•微生物实验控制5：无菌操作实验一：微生物基本操作•琼脂平板接种法•琼脂斜面接种法•半固体接种法•肉汤培养基接种法琼脂平板接种法•细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。琼脂平板培养基因面积大，接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。平板接种方法有多种。以下介绍平行划线法及分区划线法。琼脂平板接种法（分离培养法）分区划线法琼脂平板接种法（分离培养法）平行划线法琼脂平板接种法（分离培养法）单个菌落单个菌落以平板划线为例与无菌操作有关的环节1.点亮酒精灯并与之保持适当的距离；2.如何从无菌包内取出无菌平皿；3.培养基使用前如何确定它是否无菌；4.如何向平皿内倾注无菌培养基；5.平皿打开时间的控制；6.如何灼烧接种环；7.如何挑取菌落避免污染；8.如何在凝固的培养基内划线；9.如何在整个操作期间避免跨越无菌区；10.培养观察期间如何避免污染。琼脂斜面接种法•目的：多用于纯种细菌的增菌和保存菌种•方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许。拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：在试管口处做好标记，置37℃培养18－24小时大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面肉汤接种法•目的：用于增菌。•方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌，塞回塞，接种环灭菌，并做好标记，置37℃培养18-24小时半固体接种法（穿刺接种法）•目的：增菌和