发酵工程 第三章 发酵工业原料及其处理

发酵工程流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐发酵罐培养基制备灭菌灭菌产物分离纯化成品原料预处理发酵培养基是啥……？第三章发酵工业原料及其处理生物药物分析教研室徐茂磊本章内容第一节发酵工业原料的种类和成分第二节淀粉水解糖的制备第三节发酵培养基灭菌学习目的和要求掌握：发酵培养基的成分及优化方法；淀粉水解糖的制备工艺熟悉：熟悉发酵培养基灭菌原理及方法了解：了解发酵培养基灭菌工艺第一节发酵工业原料的种类和成分一、发酵培养基成分二、工业上常用作碳源的原料三、工业上常用作氮源的原料四、发酵培养基中的无机盐和生长因子五、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等一、发酵培养基成分发酵培养基即要有利于微生物的生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的合成。成分：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水等（前体、产物促进剂和抑制剂）发酵培养基提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配置的多种营养物质的混合物。发酵培养基的要求培养基能够满足产物最经济的合成--经济发酵后所形成的副产物少--纯度高培养基的原料资源丰富，价格低廉，能保证生产上的供应--成本低，可靠性高有利于产品的分离纯化，并尽可能减少“三废”物质--易控制，好处理二、工业上常用作碳源的原料作用：提供微生物合成细胞结构所需碳素，更重要的是提供目的产物中的碳及合成产物的能源。来源：糖类（淀粉，淀粉水解糖，糖蜜）、油脂、有机酸、正烷烃发酵培养基含量远远大于种子培养基淀粉质原料含淀粉较高，来源广泛，价格便宜，淀粉质原料及水解液是发酵工业常用的碳源。主要有工业淀粉、谷类、薯类等。工业淀粉包括玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉等，谷类包括大米、高粱、大麦和小麦，薯类则包括甘薯、马铃薯和木薯等。微生物能否直接利用淀粉作原料？三、工业上常用作氮源的原料构成菌体构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮产物的氮素来源。氮源物质在发酵培养基基中的含量因发酵目的产物不同而不同。分为无机氮源（速效氮源）与有机氮源无机氮源被菌体作为氮源利用后，在培养液中留下酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。(NH4)2SO4→2NH3+2H2SO4NaNO3+8[H]→NH3+2H2O+NaOH发酵工业常用的蛋白质原料主要有黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母膏、鱼粉等。无机氮源包括氨水，尿素，硝酸盐。各种原料应注意进行选择，对发酵影响较大。成分黄豆饼粉棉籽饼粉花生饼粉玉米浆鱼粉米糠酵母膏蛋白质/%碳水化合物/%脂肪/%纤维/%灰分/%干物/%核黄素/（mg/kg）硫胺素/（mg/kg）泛酸/（mg/kg）尼克酸/（mg/kg）吡哆醇/（mg/kg）生物素/（mg/kg）胆碱/（mg/kg）精氨酸/%胱氨酸/%甘氨酸/%异亮氨酸/%亮氨酸/%赖氨酸/%甲硫氨酸/%苯丙氨酸/%51.0-135.7923.062.414.521--27503.20.62.41.12.53.42.90.641281.5136.5904.414.344---24403.31.02.40.91.52.21.60.545235125.590.55.37.348.4167--16704.60.73123.11.30.6245.8118.8505.730.8874.683.619.40.886290.40.51.10.30.90.10.20.5725.01.5218.193.610.11.1931.414.7-35604.90.83.52.04.56.86.82.51345131416912.642223.2297--12500.50.10.90.20.40.60.50.450-031095-------3.31.4-1.65.56.26.52.1四、发酵培养基中的无机盐和生长因子主要功能：构成菌体成分，作为酶的组成部分或维持酶的活性，调节渗透压、pH、氧化还原电位等。大量元素（P、S、K、Mg、Ca）微量元素（Cu、Zn、Mn、Mo、Co）无机盐1.磷酸盐功能：磷是细胞膜和某些蛋白质、核酸的组成成分磷具有活化糖类分子的作用磷是能量载体ATP的组成成分磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用微生物对磷的需要量一般为0.005～0.01mol/L常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO42.硫酸镁（硫元素、镁元素）Mg2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂。Mg2+能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分。硫构成一些酶的活性基钾不参与细胞结构物质的组成，是许多酶的激活剂菌体生长所需钾量约为0.1g/LKH2PO4、K2HPO43.钾盐4.微量元素微生物生长所需浓度在10-8-10-6mol/L范围内需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/mL，发酵罐必须进行表面处理。使用注意对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素，在发酵过程中必须加以考虑微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。5.生长因子（growthfactor）例：以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子，生长因子对发酵的调控起到重要的作用。玉米浆、麸皮水解液、糖蜜等加入到发酵培养基中，能在生物合成过程中直接被微生物合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，却能提高产物产量的小分子物质。例：青霉素发酵添加玉米浆产量提高1.前体青霉素G：分子量356苯乙酸：分子量136五、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂用法：普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率作用：有助于提高产量1.前体工业上常见的前体产物前体产物前体青霉素G苯乙酸等维生素B12钴化物青霉素O烯丙基-巯基乙酸丝氨酸甘氨酸青霉素V苯氧乙酸色氨酸吲哚、氨茴酸链霉素肌醇、精氨酸灰黄霉素氯化物金霉素氯化物异亮氨酸D-苏氨酸红霉素丙酸、丙醇苏氨酸高丝氨酸非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后可以影响微生物的正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物产量的添加剂。专一性强，用量极微，需注意选择品种及确定用量。2.促进剂添加剂酶微生物酶活力增加倍数Tween(0.1%)大豆酒精提取物（2%）植酸质（0.01%-0.3%)洗净剂LS(0.1%)聚乙烯醇苯乙醇(0.05%)醋酸+维生素纤维素酶蔗糖酶-葡聚糖酶木聚糖酶淀粉酶脂酶右旋糖酐酶普鲁兰酶蛋白酶脂肪酶蛋白酶蛋白酶糖化酶纤维素酶纤维素酶许多真菌许多真菌许多真菌许多真菌许多真菌许多真菌绳状青霉产气杆菌米曲霉泡盛曲霉曲霉、桔青霉等栖土曲霉筋状拟内胞霉真菌绿色毛霉201610446201.52.872.502-41.61.24.42各种促进剂对产酶的促进作用促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的：有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进产物的分泌与生产；对发酵产物具有稳定作用；对发酵微生物有益，使发酵过程更顺利。2.促进剂加入后可抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致改变微生物的代谢途径的添加剂。如酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以使酒精发酵受到抑制，而转入甘油发酵如甘露聚糖可以抑制甘露糖链霉素生产，只产生链霉素。3.抑制剂营养缺陷型菌株？产物被抑制的产物抑制剂链霉素去甲链霉素四环素去甲金霉素头孢霉素C利福霉素B甘露糖链霉素链霉素金霉素金霉素头孢霉素N其他利福霉素甘露聚糖乙硫氨酸溴化物、硫脲硫磺化合物、乙硫氨酸L-蛋氨酸巴比妥药物某些代谢产物的抑制剂发酵培养基与种子培养基主要区别在哪……？小结发酵培养基的组成特点碳源物质添加量远大于种子培养基；氮源添加根据实际情况确定；无机盐是发酵培养基的必须成分，十分重要；生长因子的存在需要精确控制；前体物质必须确定好添加的浓度和时间；促进剂和抑制剂在一定程度上可以帮助发酵。第二节淀粉水解糖的制备淀粉质原料因为大多数微生物不能直接利用或利用较少，因为它们不含淀粉酶和糖化酶，所以必须水解为葡萄糖等可发酵糖类，才能被利用。一、淀粉糖化及淀粉水解糖二、淀粉水解的原理三、淀粉水解的方法一、淀粉糖化及淀粉水解糖工业上将淀粉水解为葡萄糖的过程叫做淀粉的糖化。所制备的糖液叫做淀粉水解糖。葡萄糖（glucose）淀粉水解糖液麦芽糖（maltose）复合糖类、低聚糖等其他分解产物（氨基酸、脂肪酸等）淀粉水解糖被广泛用于各种发酵工业，水解糖质量的高低，直接影响菌体的生长和产物的积累。不能利用淀粉水解总的趋势是大分子向小分子转化，随着淀粉水解程度的增加，糖化液的还原性不断增加。淀粉水解的化学反应可简单表示如下：（C6H10O5)n+nH2On(C6H12O6)二、淀粉水解的原理淀粉糊精（7-12个葡萄糖残基组成）麦芽糖（2个葡萄糖残基组成）葡萄糖分解反应复合反应5-羟甲基糠醛复合二糖低聚糖有机酸、有色物质水解反应二、淀粉水解的原理1.淀粉的水解反应淀粉→糊精→低聚糖→麦芽糖→葡萄糖它们遇碘呈不同的颜色，淀粉遇碘呈蓝色，糊精按分子从大到小的顺序，遇碘呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，麦芽糖遇碘不呈色。利用显色反应检测淀粉的水解程度2.葡萄糖的复合反应淀粉水解过程中，部分葡萄糖在热和酸的作用下发生聚合反应生成低聚糖对发酵有害：降低原料水解效率，抑制微生物生长，使发酵液中残糖增加，提取精制困难反应可逆：酸水解可再次转变为葡萄糖影响因素：葡萄糖浓度、淀粉乳浓度、酸度和酸的种类葡萄糖脱水：5-羟甲基糠醛→乙酰丙酸→甲酸等对发酵有害：产生色素，影响糖液质量影响因素：加热时间、pH值、葡萄糖浓度3.葡萄糖的分解反应色素二、淀粉水解的原理在淀粉的水解过程中，三种反应同时发生。应尽量减少复合反应和分解反应，因为它影响菌体的正常发酵及工厂的生产成本。取决于水解条件Q：如何控制水解条件，降低复合分解反应的发生？三、淀粉水解的方法原料：薯类、玉米淀粉、小麦淀粉和大米淀粉等含淀粉原料。根据水解采用的催化剂不同，可以分为三种方法酸水解(acidhydrolysismethod)酶水解(enzymatichydrolysismethod)酸酶结合水解(acid-enzymatichydrolysismethod)1.酸水解法也叫做酸糖化法，以无机酸或有机酸为催化剂，高温高压下将淀粉水解为葡萄糖。优点：工艺简单、设备简易、生产周期短、设备生产能力大；缺点：设备耐高温高压、副反应多、原料要求严格、淀粉乳浓度适宜。（1）淀粉酸水解法工艺流程淀粉水解糖不需要提纯葡萄糖，质量只要能满足发酵要求即可。淀粉水盐酸调浆糖化蒸汽冷却中和脱色碳酸钠活性炭压滤滤渣糖液（2）淀粉酸水解法工艺条件确定选择工艺条件尽量减少复合与分解反应，提高原料利用率，提高糖液质量。淀粉原料无机酸种类与用量水解温度与压力淀粉乳浓度糖化终点①淀粉原料酸法水解的重要特点是非专一性。尽量减少杂质含量，选择纯度较高的淀粉。杂质的危害：蛋白质可降解生成氨基糖，引起细菌细胞收缩，还可能引起发酵泡沫过多，脂肪灰分等可以降低酸的效能。糖化工艺根据实际淀粉的特点进行相应的改进。酸水解对淀粉质量的要求项目指标水分11~14总蛋白质0.3~0.5水溶性蛋白质0.01~0.02脂肪0.04~0.06粗纤维0.01~0.02②无机酸种类与用量盐酸(hydrochloricacid)：催化效能最高硫酸(sulph