5.细菌的生理生化反应

细菌的生理生化反应生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。•糖酵解试验•过氧化氢酶试验•淀粉水解试验•V-P试验•甲基红（MethylRed）试验•靛基质（Imdole）试验•枸椽酸盐试验：•尿素酶（Urease）试验•硝酸盐还原试验•三糖铁（TSI）琼脂试验•动力试验API系列VITEK®全自动化微生物鉴定系统原理：细菌含有发酵糖（醇、苷）的酶分解糖类产酸、产气、或仅产酸。培养基：含有0.5%-1%的糖（醇、苷）的液体、半固体、固体、或微量生化管。方法：纯菌种接种培养基，要求的温度，数小时至两周，微量管注意保持湿润，以免干燥。结果：能分解糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若能产气时，培养基可出现开裂气泡等现象意义：肠杆菌科尤为重要根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。[方法]：取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37℃温箱培养18－24小时，观察结果。[结果]：1、确定细菌是否生长2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“”表示。4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。大肠杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌葡萄糖+乳糖--葡萄糖：+-麦芽糖：-+甘露醇：+-鼠李糖：-+原理：细菌分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；可以进行无氧降解的，称为发酵型；不分解葡萄糖的称为产碱型培养基：HL二氏培养基方法：待测菌同时接种两只HL培养基，其中一只滴加无菌的液体石蜡，高度不少于1cm，35℃培养48h或更长结果：两只均无变化为产碱型；两只均产酸为发酵型；仅不加石蜡的产酸为氧化型意义：肠杆菌科与非发酵菌的鉴别；葡萄球菌与微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型原理：有的细菌可以产生β半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚-β半乳糖苷生成黄色的邻-硝基酚方法：从KIA上取菌，于0.25ML无菌生理盐水中制菌悬液，加甲苯一滴，使酶释放。37℃水浴5min,加0.25mlONPG试剂，水浴20min-3h观察结果结果：呈现黄色为阳性，一般20-30min内显色意义：迅速及迟缓发酵乳糖的细菌为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴注意：该试验不一定与分解乳糖相一致，决定于细菌产生的酶及其活性原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物，使培养基呈黑色方法：将待测菌接种于七叶苷培养基，培养后观察结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：D群链球菌与其他链球菌的区别，前者为阳性；肺炎克雷伯、阴沟肠杆菌多阳性+-原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的PH降至4.5以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的PH仍在6.2以上，加入甲基红试剂后显黄色，为阴性培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基，2-4天后，加入甲基红试剂，观察结果结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性意义：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性甲基红试验阳性阴性对照大肠杆菌：+产气杆菌：—原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。α奈酚可加速此反应培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基，35℃48h，加入甲液（6%α奈酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液）结果：20min内出现红色为阳性，如无红色，且于35℃4h后仍如故即为阴性意义：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后者多阴性VP试验阴性阳性大肠杆菌：—产气杆菌：+原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚培养基：蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基，35℃培养24-48小时，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性试剂：柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）与欧氏试剂的区别：前者含戊醇，后者含酒精，都含浓盐酸，前者主要成分为后者10倍，后者灵敏度更高阳性吲哚试验大肠杆菌：+伤寒杆菌：-玫瑰红色原理：细菌产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体变为液体方法：待测菌接种于明胶培养基，22℃培养7天。若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察前先置4℃冰箱30min再观察结果：培养基呈液化状态为阳性意义：多数假单胞菌能液化明胶，肠杆菌科细菌如：沙雷菌、变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。培养基：醋酸铅培养基方法：待测菌接种于醋酸铅培养基，35℃培养24-48小时观察结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性H2S试验原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性培养基：尿素培养基方法：待测菌接种于培养基，35℃培养18-24小时观察结果结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性意义：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷伯氏为阳性1未接种2尿素酶阳性3尿素酶阴性原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：待测菌接种于培养基，35℃培养18-24小时，加10%三氯化铁试剂3-4滴，观察结果结果：肠杆菌科变形杆菌、普罗维登氏菌、摩根氏菌阳性原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显色培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基方法：待测菌接种于培养基，并加入无菌液体石蜡，35℃培养18-24小时观察结果结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色，（指示剂为溴甲酚紫）测定管呈黄色为阴性；若对照管呈紫色则试验无意义意义：肠杆菌科细菌的鉴定原理：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱培养基：枸橼酸盐培养基方法：待测菌接种于培养基35℃培养18-24小时，观察结果结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性意义：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性枸橼酸利用试验大肠杆菌：—产气杆菌：+原理：有的细菌可利用丙二酸盐为唯一碳源，将其分解生成碳酸钠，使培养基变碱试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺方法：待测菌接种于培养基35℃培养18-24小时，观察结果结果：培养基由淡绿变为深蓝为阳性，无变化则为阴性意义：肠杆菌科属间鉴别原理：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物培养基：丙二酸盐培养基方法：菌落法、滤纸法、试剂纸片法。前二者浪费试剂，后者节省结果：10秒内呈深紫红色为阳性意义：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别，前者阴性，后者多阳性奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡试剂：3%过氧化氢溶液方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3%过氧化氢数滴，观察结果结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性意义：用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄球菌和微球菌为阳性，链球菌和肠球菌为阴性，肠球菌多假阳性原理：硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，氨再转化为氨基酸和其他含氮化合物；硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸系统中的终末受氢体。有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐，有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵，有的能使其还原为氮培养基：硝酸盐培养基方法：待测菌接种于培养基，35℃培养18-24小时，将甲乙液分别加入培养基，立即观察结果结果：出现红色为阳性意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气；链球菌肠球菌阴性，葡萄球菌阳性注意：若加入试剂后无反应，可能是①硝酸盐没有被还原，试验阴性②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性没有颜色变化：加入少量锌粉－变红－阴性（硝酸盐未被还原）－不变－阳性（亚硝酸盐已经分解成氨和氮）原理：G+菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而G+菌在稀碱溶液中没有上述变化。方法：取1滴40g/LKOH水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与KOH水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝。结果：用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴性。应用：主要用于G-菌与易脱色的G+菌的鉴别。大多数G-菌于5-10s内出现阳性反应，有的则需30-45s，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60s内出现阳性，而G+菌在60s以后仍为阴性。某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解，后者可被酸沉淀，长链DNA水解后形成的寡核苷酸链则溶于酸，所以在平板上加入酸后会在菌落周围形成透明环培养基：0.2%DNA琼脂平板方法：点种被测菌于上述平板，35℃培养18-24小时；用1mol/L盐酸覆盖平板，观察结果结果：菌落周围出现透明环为阳性意义：金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、变形杆菌阳性原理：致病性葡萄球菌；结合凝固酶、游离凝固酶；纤维蛋白原变为纤维蛋白使血浆凝固方法：1玻片法检测结合凝固酶兔血浆2试管法检测游离凝固酶0.5ml兔血浆37℃水浴3-4结果：玻片法中有明显颗粒样凝集而盐水对照无凝集为阳性；试管法以血浆凝固为阳性意义：致病性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌多阳性原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β溶血毒素活性，在两菌的交界处溶血力加强，出现矢形溶血区培养基：BAP方法：先以产β溶血毒素的金葡菌划一横线接种于BAP，再将被测菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，0.5-1cm，37℃培养18-24小时观察结果，设阴阳性对照结果：在两划线交界处出现箭头样溶血区为阳性意义：B群链球菌阳性，马红球菌出现反CAMP现象原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，使细菌发生自溶试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁方法：平板法：滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35℃30min观察结果。试管法：0.9ml被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1ml后置35℃水浴10-30min观察结果结果：菌落消失，或培养物变透明为阳性意义：肺炎链球菌阳性主要用于厌氧菌的鉴定产气夹膜梭菌卵磷脂酶阳性中间类杆菌脂酶阳性致病性葡萄球菌硷性磷酸酶阳性，如金黄色葡萄球菌等原理：O/129（二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用培养基：碱性琼脂培养基方法：纸片法药敏40μg/片结果：有抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药意义：弧菌、邻单胞菌敏感；气单胞菌属耐药原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而其他链球菌则耐药培养基：BAP方法：同纸片法药敏0.04U/片结果：＞10mm敏感；＜10mm耐药意义：A群链球菌敏感原理：肺炎链球菌对Optochin敏感，其他链球菌无抑制作用培养基：BAP方法：同纸片法药敏5μg/片结果：抑菌环直径＞14mm敏感；≤14mm耐药此时加做胆汁溶