1-分子生态学-分子标记技术201603

19:391第4讲分子标记技术一、分子标记的相关知识什么是遗传标记？遗传标记(geneticmarker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性两个基本特征:可遗传性和可识别性生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记遗传标记的类型形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)：DNA分子遗传标记，或DNA标记。形态标记个体的外部形态特征简单直观、经济方便但数量在多数有限、多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。细胞遗传标记细胞染色体的变异包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位费时费力，技术有难度；有些变异难以用细胞学方法进行检测。生化标记同工酶或等位酶标记。同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。两个方面的优点：一是共显性特性；二是直接反映了基因产物差异。应用有限：一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。分子标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。优越性表现为：（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。分子标记来源于DNA水平的突变和重组•突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。•多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。分子标记的类型第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNAFingerprinting）、原位杂交（insituhybridization）等；第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simplesequencelengthpolymorphism,简称SSLP标记）、扩增片段长度多态性标记AFLP、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等；第三类是基于DNA序列和芯片的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性长度片段多态性）原位杂交（insituhybridization）第一类：基于核酸杂交的分子标记RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA）DAF（DNAamplificationfingerprinting）SSCP（Singlestrandconfirmationalpolymorphism）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）微卫星DNA（MicrosatelliteDNA）,又称SSR（Simplesequencerepeat）ISSR（Intersimplesequencerepeat）AP-PCR（ArbitraryprimerPCR）SCAR（Sequencecharacterizedamplifiedregion）STS(Sequencetaggedsite)基于PCR技术的DNA扩增方法第二类：基于PCR的分子标记AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增CAPS（Cleavedamplifiedpolymorphicsequence）CAPS是先扩增，再酶切扩增片段PCR与酶切相结合的方法SNP（Singlenucleotidepolymorphism）表达序列标签EST标记第三类：基于DNA序列的分子标记CAPACITY1985199019952000Multi-SSRsAFLPsSSRsRAPDsRFLPsSNPsHiSpeedsequSRAP,TRAP分子标记的发展二、几种分子标记介绍英文缩写英文名称中文名称RFLPRestrictionfragmentIengthpolymorphism限制性片段长度多态性STSSequencetaggedsite序列标签位点RAPDRandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩增多态性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism扩增片断长度多态性SSRSimplesequencerepeat简单序列重复SNPSimplemucleotidepolymorphism单核苷酸多态性几种主要的ＤＮＡ分子标记1.限制性片段长度多态性标记RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP：限制性片段长度多态性，为第一代多态性记原理：RFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而引起DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。RFLP原理示意图•GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAG•CATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTCEcoRIEcoRI酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性RFLP是由DNA序列的变异造成的。然而，如果DNA变异的位点不在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内切酶的种类来弥补。在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，可用到6到8种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多态性大不相同。技术路线：不同个体DNA的提取酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析RFLP显性标记or共显性标记RFLP的特点A、不受环境条件和发育阶段的影响B、是共显性的，可区分纯合子和杂合子C、需要对探针进行标记，还要Southern杂交，耗时费力D、DNA需要量大，难以用于大规模的育种RFLP研究的发展基因组DNA酶切对象PCR产物末端荧光标记的PCR产物RFLPPCR-RFLPTRFPGeetal.2001.Genome44:1136-1142IdentificationofricegenomesbyPCR-RFLPofAdhgenesTRFPTerminalrestrictionfragmentpatterns欧洲帚石楠2.随意扩增多态性DNA标记—RAPDRandomAmplifiedPolymorphismicDNA原理：由单个短的随机序列引物（10bp）对基因组进行PCR扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件，就可以产生扩增片段。RAPD扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合位点间发生了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺失。WMWMRAPD原理示意图4/50RAPD•实验流程DNA提取PCR扩增产物检测数据记录电泳图RAPD•数据记录0–1矩阵显性标记有有有有无有１１１１０１12/50RAPD•RAPDrandomamplifiedpolymorphicDNA10碱基Williamsetal.1990•AP-PCRarbitraryprimerPCR20,30碱基Welshetal.1990•DAFDNAamplificationfingerprinting5,8个碱基Caetano-Anollesetal.1991RAPD标记的特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。3.扩增片段长度多态性标记—AFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphism1992年，荷兰科学家Zabeau和Vos由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。原理示意图AFLP技术路线•1.基因组DNA被酶切成小片段：通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DNA片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测；•2.接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，MseI接头和EcoRI接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；•3.预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步的产物可以通过Agarose胶检测。•4.选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。AFLP电泳图select20polymorphismmarkersfrom256primers123123123123优点1）非常高的基因型分析效率；2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；3）不需要基因组DNA序列信息；4）AFLP分析只需要很少量的DNA；(typically0.2to2.5μgperindividual)；􀂇5）AFLP可应用于任何生物；6）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传。缺点1）需要高质量的DNA，以确保酶切完全；2）从单个多态性DNA片段开发位点特异性标记相当困难；3）多数情况下采用的是同位素标记；4）在染色体上不均匀分布，AFLP标记经常在着丝粒附近区域高度聚集AFLP标记技术的应用遗传连锁图谱的构建亲缘关系和遗传多样性的研究种质资源鉴定分子标记辅助选择育种基因表达和基因克隆4.简单重复序列标记—SSR（simplesequenceRepeats）或者称为微卫星DNA（microsatelliteDNA）•原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—5bp之间，常见的微卫星如(TG)n、(GA)n、(AAT)n或(GACA)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(FlankingRegion)，寻找其中的特异保守区。GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAABCABCSSR原理示意图技术路线：•建立DNA文库筛选鉴定微卫星DNA克隆测定这些克隆的侧翼序列设计特异性引物来扩增SSR序列经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR