基因克隆毕业论文

...........大学本科生毕业论文（设计）题目芝麻谷氨酸合成酶和β-1，3葡聚糖酶基因的克隆学院专业班级学生姓名指导教师撰写日期：2013年5月1日芝麻谷氨酰胺合成酶和β-1，3，葡聚糖酶基因的克隆......................摘要:芝麻（SesamumindicumL.）属胡麻科胡麻属，是我国重要的油料作物之一。谷氨酰胺合成酶（Glutamatesynthase，GS）对于提高氮素利用效率有很大作用，而β-1,3葡聚糖酶（beta1,3glucanenzyme,β1,3GE）与植物的抗病性有关。为了研究芝麻谷氨酰胺合成酶和β-1,3葡聚糖酶的功能，利用前人建立的芝麻全长cDNA文库，进行上述基因的克隆。芝麻GS基因的cDNA全长为1290bp。β1,3GE基因的cDNA全长为1028bp。关键词：芝麻，基因克隆，谷氨酰胺合成酶，β-1．3，葡聚糖酶Abstract：Sesame(SesamumindicumL.),whichbelongstoSesamumgenusinPedaliaceaefamily,isoneoftheimportantoilcropsinChina.Theglutaminesynthetase(GS)isveryhelpfulforimprovingutilityefficiencyofnitrogen,andbeta1,3glucanenzyme(β1,3GE)isassociatedwiththediseaseresistanceofplant.InordertostudytheGSandβ1,3GEfunction,thefull-lengthsesamecDNAlibrarywassuedforgenecloning.ThefullcDNAlengthofsesameGSandβ1,3GEgeneswas1290bpandof1028bp,respectively.Keyword：Sesame,Genecloning,Glutaminesynthetase,Beta1,3glucanenzyme引言【研究意义】芝麻属胡麻科（Pedaliaceae）胡麻属（SesaumuLinn），是世界上重要的优质油料作物之一。其种子含油量为50%—60%，蛋白质含量为20%—30%，且富含芝麻酚、维生素E等天然抗氧化类物质。中国芝麻年种植面积80万公顷，总产量约75万吨，居世界首位[1]。但是，由于芝麻生长发育易受气候条件影响，特别是抗病耐渍性较差，涝害等不良气候因素常导致产量和品质大幅度下降。长期以来，由于芝麻基础研究起步较晚，缺乏与芝麻生长发育相关的分子标记开发、遗传图谱构建[2-4]以及QTL定位等基础性研究成果的支撑，芝麻优质高产、抗病抗逆育种研究进展缓慢。开展芝麻生长发育等相关分子生物学基础研究对于从根本上解决中国芝麻生产中存在的突出问题具有十分重要的意义。氮素是影响植物生长发育的主要因素。无论是直接来源于硝酸盐、氨离子、微生物固定氮，还是植物代谢过程中释放的氨，都必须经过谷氨酰胺合成酶（GS）催化才能同化为氨基酸。GS和谷氨酸合成酶（Glutamatesynthase,GOGAT)构成的GS-GOGAT循环式高等植物氮素同化的主要途径。大麦、玉米、水稻、拟南芥等植物的GS基因已被克隆，GS功能研究已经成为提高氮素利用效率的研究热点之一。β-1,3葡聚糖酶(β1,3GE)在高等植物中广泛存在。70年代以前，对此酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用．如种子中葡聚糖的降解、细胞延长、花粉管伸长、四分体小孢子发育、育性及韧皮部肼胝质去除等。以后在病原物侵染的植物中检测到大量β-1,3葡聚糖酶的存在，且发现它在体外可以降解病原真菌细胞壁并释放出寡糖激发子进而诱导植物其它的防御反应。由此对β-1,3葡聚糖酶的研究开始集中于抗病方面。【前人研究进展】近年来，高通量转录组测序技术的不断发展和完善为开展不同生物功能基因组学研究提供了全新的思路和方法，并已被广泛应用到了包括人类、酵母、甘草、拟南芥、大豆、老鼠等多个物种的研究中。Zhang和Wei等[3-4]于2012年首次报道利用该技术进行芝麻转录组研究，并对芝麻转录组整体特征进行了初步的分析，获得了数万条unigene序列，在很大程度上丰富了芝麻序列数据，为芝麻的功能基因的克隆研究奠定了良好的基础。【本研究切入点】前人研究中进行芝麻转录组的研究与分析，为后人在功能基因的研究上提供了基础。本实验室利用芝麻品种“豫芝11号”转录组测序所获得序列信息，预测得到两条有重要功能的芝麻全长序列：谷氨酰胺合成酶和β-1,3葡聚糖酶。本研究根据已设计好的上述两条基因的全长引物来扩增芝麻cDNA，以期获得目标基因的全长cDNA序列。【拟解决的关键问题】本研究拟通过开展克隆转化及测序分析，获得芝麻谷氨酰胺合成酶和β-1,3葡聚糖酶基因的全长cDNA序列，为今后芝麻重要基因的功能验证等研究奠定基础。1材料和试剂1.1植物材料芝麻品种豫芝11，河南农科院芝麻中心提供。1.2菌种受体菌：大肠杆菌DH5α。1.3试剂克隆载体试剂盒购自Takara公司；胶回收试剂盒及其他相关试剂盒购自上海生工生物公司。1.4仪器台式离心机，PCR仪，超净工作台，摇床，紫外凝胶成像系统，琼脂糖凝胶水平电泳槽，电泳仪，涡旋器等。2试验方法2.1方法流程2.2总RNA提取及mRNA分离材料总RNA提取方法参照Invitrogen公司的TrizolReagent说明书进行。按Promega公司DNaseⅠ方法对样品中的DNA进行消化处理。用1.2%琼脂糖凝胶电泳和Agilent2100RNA6000Kit检测确定总RNA完整性和纯度质量后，按DynabeadsmRNAPurificationKit（Invitrogen）说明书对mRNA进行分离纯化。2.3mRNA片段化及cDNA片段合成在200μL薄壁PCR管中加入FragmentationBuffer（LC-Bio）和mRNA，94℃反应5min将mRNA随机打断成片段；用随机引物和逆转录酶将RNA片段反转成cDNA第一链片段，并合成第二链cDNA，利用QIAquickPCRPurificationKit试剂盒对双链DNA片段进行纯化。以上具体试验操作步骤均按照mRNA-Seq8-SamplePrepKit试剂盒说明书进行（Illumina）。2.4PCR扩增2.4.1引物筛选两条全长引物序列根据河南省芝麻研究中心芝麻转录组数据（，登录号：JP631635-JP668414）设计。由华大基因公司合成。谷氨酰胺合成酶:FTTGCCCTTCTGCTCTACATTRTTGCCCTTCTGCTCTACATTβ-1,3葡聚糖酶:FAGCTTTGTCTTTTTTCCTACCARAAATAAGGGTGAATTGCTTACC2.4.2PCR体系DNA1μlPrimerF1μlPrimerR1μl10×PCRBuffer1μldNTP0.2μl酶0.2μlddH2O6μl反应总体系为10μl2.4.3PCR程序PCR反应在PTC-100(MJresearch)热循环仪上进行，反应程序为：95oC预变性3Min；94oC变性30Sec；57oC退火30Sec；30cycles.72oC复性2min；72oC延伸6min；14oC保温forever（通常1min即可停止。）2.4.4琼脂糖胶电泳检测扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳：电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20-30分钟。琼脂糖凝胶时加入Joldview染色剂，电泳完成后在紫外凝胶成像系统下读胶，并照相存档。在紫外灯下切下大于1000bp的目的条带，用于回收。2.5DNA回收使用生工生物公司的胶回收试剂盒回收，具体步骤如下：1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。凝胶块转移至1.5ml离心管中，称重得出凝胶块的重量。2.根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖加300-600ul的比例加入BufferB2.3将离心管置于50℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全消失。4将溶化好的溶液全部移入吸附柱中，8000rpm离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5.向吸附柱中加入500μlWarshSoluhion，9000rpm离心30s。6重复步骤5一次。7.将空吸附柱和收集管放入离心机中，9000rpm离心1min。8..把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入15~30μl（具体取决于预期的终产物浓度）的ElutionBuffer(或TE缓冲液)到吸附膜中央，室温放置2min,9,000rpm离心1min以洗脱DNA。9.将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。2.6连接采用Takara的pMD○R18-TVector载体连接试剂盒，体系如下：pMD○R18-TVector1μlSolutionⅠ5μlDNA2μldH2Oupto10μl2.7制备感受态（DH5α）1.吸取2μl保存的有活力菌液于5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37.0℃、200rpm震荡培养过夜。2.转移4ml上述菌液，加入50ml不含抗生素的LB液体培养基中，37.0℃、200rpm震荡培养至OD600=0.5左右。3.冰上放置10min.4.4℃、4000rpm，离心10-15min,沉淀大肠杆菌细胞。5.弃去上清液，并向沉淀中加入10ml预冷的0.1mol/LGacl2溶液，重悬吹打细胞。6.冰上放置30min。7.4℃、4000rpm，离心10-15min,沉淀大肠杆菌细胞。8.弃去上清液，沉淀中加入2ml预冷的0.1mol/LGacl2溶液，重悬细胞。9.加入终浓度为15-25％的甘油水溶液，100μl分装，-80℃保存备用。2.8转化1.在100μl感受态细胞加入待转化的DNA5μl，轻轻吹打几下混匀，冰浴30min。2.将离心管放置在42℃水浴中，热激90s.3.快速将离心管转移至冰上，放置2-3min。4.在离心管中加入800μl的LB培养基，37℃、140rpm振荡培养1h。5.取200μl转化的感受态细胞，转移到含的LB固体培养基上。6.待平板表面菌液被吸收后，封好培养皿，倒置与37℃中，培养12-16h。2.9挑菌检测1.挑菌培养：用灭过菌的牙签挑取单菌落于800ml含有抗生素的LB液体培养基中，37℃、140rpm震荡培养2h。2.菌液PCR:将上述菌液作为模板，分别进行特异引物和M13引物PCR扩增。3.琼脂糖胶电泳：将同一模板的扩增产物进行对比。2.9测序将阳性结果送往华大基因生物公司进行测序。3结果分析3.1PCR电泳结果图一目的基因的cDNA扩增结果图一左边泳道为β-1,3葡聚糖酶的扩增结果，右边泳道为GS的扩增结果。由图上可看到，左边条带比右边条带稍低，且二者均高于1000bp。条带大小与理论结果基本吻合，分别切下含有目的基因的胶进行产物回收、纯化。3.2胶回收检测结果图二目标基因的产物回收、纯化结果将胶回收产物进行电泳检测，结果图二，可看到回收纯化的目的基因条带清晰明亮，可用于连接、转化。3.3转化平板结果图三GS基因转化结果图四β-1,3葡聚糖酶基因转化结果分别挑取多个单菌落进行特异引物和M13引物扩增，并跑电泳对比。3.4菌液PCR检测结果M13引物的扩增结果要比特异引物的扩增结果大50bp左右，另外对比阳性对照，确定阳性结果。3.5结果及分析GS测序结果：序列如下TTGCCCTTCTGCTCTACATTTTTGCTGCAATTTTCAGCCAGGGAAGGTGAAAATGGCACAAATCTTGGCCCCTTCTGCGCAATGGCAGATGGGAATTTCAAAGGGGTTAACAGATGCAACCCCACTGACTACAAAGATGTGGGGCTCTCTTGCTTTGAAACAAGGCTC