枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究

毕业设计(论文)课题名称枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究2014年5月15日1目录摘要··········································································2Abstract············································································31前言··············································································42材料与方法····································································72.1实验试剂与材料························································72.2主要仪器与设备························································72.3试验方法·································································83结果与分析····································································83.1枯草芽孢杆菌的标准曲···············································93.2单因素试验结果······················································103.3正交试验结果分析·····························错误!未定义书签。4结论和讨论··································································155参考文献······································································166致谢············································································172枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究摘要本文通过单因素实验和正交试验研究枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验及正交试验得到最佳的发酵培养条件为：初始pH7.0；温度35℃；时间20h；接种量为5%。在此培养条件下的活菌液量为3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右。关键字：枯草芽孢杆菌；正交试验；生长量3OptimizationstudyofbacillussubtiliscultureconditionsAbstractInthispaper,westudyBacillussubtilis(Bacillussubtilis)fermentationconditions(PH,temperature,time,quantityof)theimpactonthegrowthofBacillussubtilis.Theexperimentofbacillussubtilisincombinedcultivatedinliquidmedium,isobtainedbysingleforexperimentandtheorthogonalexperimentthebestfermentationcultureconditionsasfollows:theinitialPH7.0.Temperature35℃;Time20h;Inoculationquantitywas5%.Undertheconditionofthecultivationofthebestamountofbacteriumfluidis3.785x107cfu/ml,comparedtowhenculturedinLBmediumunderthemicrobialquantity:3.231x107cfu/mlbyabout10times.Keywords:Bacillussubtilis;Cultureconditions;increment41前言枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种好氧性产芽孢杆状细菌(G+)[1]，其基本特征：杆菌：一般0.7-0.8×2.0-3.0µm，电子显微镜测量为0.5-0.6×1.1-3.5µm，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。由于枯草芽孢杆菌是需氧菌在水质净化[2]、工业发酵中发挥着重要的作用，人们开始致力于研究枯草芽孢杆菌应用于这些方面的研究。关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史，早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。但目前对该菌种的研究仍然处于实验室的初始阶段的水平。但是枯草研报杆菌有一系列的优良性状吸引这一些的科学家的目光，他们相信随着经济的发展，枯草芽抱杆菌资源对在工、农、医等方面有重大应用价值，开发利用更具有重要意义。枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好养型细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强[3]，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于枯草芽孢杆菌生长速度快，营养需求简单，易于存活，定殖与繁殖，无致病性，并可以分泌多种酶和抗生素[4,5]，而且还具有良好的发酵基础，用途十分广泛，国内外有众多研究单位和学者对此菌进行了大量研究，也积累了丰富的研究资料。通过对枯草芽孢杆菌系列的研究，一方积累枯草芽孢杆菌规律信息为以后开发提供依据；另一方面也可了解芽孢杆菌与生态环境间的相互关系，为芽孢杆菌资源的利用奠定基础[6]。现在对于枯草芽孢杆菌的主要运用方面：（1）在水产养殖中的应用随着水产养殖业的迅猛发展和集约化经营程度的不断提高，养殖水体污染日趋严重，许多养殖池中有害藻类及病菌大量繁殖，水质条件不断恶化，其后果影5响到了水产品安全和产业的可持续发展[7]。利用常规药物防治方法，不但易加重水质恶化程度，成本也较高，而利用微生物制剂改善养殖水体环境受到人们越来越多的关注。枯草芽孢杆菌是一种好氧的革兰氏阳性菌，在自然界广泛存在，生命力极强，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力[8]。枯草芽孢杆菌能有效的降解水体中的氨氮、亚硝酸盐和硫化物，达到净化水质的目的。因此，枯草芽孢杆菌在养殖水体的生物修复方面得到了广泛的应用[9,10]。在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的群落，而达到防治水产疾病的目的；芽孢杆菌可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用[11]；芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质；枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很强的抑制作用，有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病。同时枯草芽孢杆菌也可以分泌大量几丁质酶的功能。几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而抑制真菌病害，分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质[12-14]；也可以分解池中残饵、粪便、有机物等，具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用。枯草芽孢杆菌还可以改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能。其在水中大量繁殖时分泌的胞外酶可分解、吸收水及底泥中的蛋白质、淀粉、脂肪等有机物，有降低水体富营养化和清除底泥的作用。在作用过程中，能够促进饲料中营养素降解，有机营养一部分转化为细胞物质，大部分转化为细菌活动的能量。在其转化过程中，氨气、氮气就从水中逸散到大气用这种方法，水中氨氮和硝基氮可除去。另一部分有机营养转化为优势的有益菌体，此法广泛应用于河蟹、育苗、虾、甲鱼养殖[15]。（2）在食品工业上的应用血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。大量的研究表明，饮食习惯与动脉硬化和血栓等疾病有密切的关系，纳豆是日本的传统食品，已经有2000多年的历史。纳豆是由纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵大豆而成。日本学者发现在枯草杆菌发现的传统纳豆(Natto)食品中含有一种具有溶解血栓功能的纳豆激酶(Nattokinase)是一种枯草杆菌蛋白激酶[16]，可6简称为枯激酶(Bacillokinase)。该酶在体内除可溶解血栓外，明显地缩短优球蛋白的溶解时间(ELT)，以及激活体内的血管内皮细胞产生t-PA，由此可见，可探索开发一种新的溶栓药品。纳豆是日本的传统食品，已经有2000多年的历史。由于纳豆中含有能溶解血栓的纳豆激酶[17]，因此很适合作为一种保健食品每天食用。研究表明，每天食用150g新鲜纳豆可起到预防血栓类疾病的作用。另外，常吃纳豆对癌症、糖尿病、高血压、动脉硬化、肥胖病等均可起到预防和缓解及治疗作用.纳豆枯草芽孢杆菌能在肠道内生长，分泌各种酶和维生素，促进小肠黏膜细胞的增殖[18-19]，促进胃肠道各种消化酶活性，并具有抑制肠道内有害菌的作用，能够将人类及其他动物难以消化吸收的大豆蛋白发酵形成大豆多肽和小分子物质的混合物；同时此菌在不利环境中形成芽胞，能耐高温高压，经受饲料加工工艺要求，易贮存。目前很多研究均显示，枯草芽胞杆菌可以产生多种抗菌物质[20]抑制病原菌的繁殖并且对生物体本身无害，可提高养殖动物的产品质量，是一种应用非常广泛的益生菌。因此，近年来枯草芽胞杆菌在饲料开发和生物防治等领域的应用成为研究热点。（3）在医药方面的应用枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶的不足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽腐肉和碎屑。枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶，其中能够应用到医药领域的酶主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶(纳豆激酶)和脂肪酶两种[21]。日本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产的，纳豆中含有的纳豆激酶对心血管疾病有很好的预防和治疗作用。近年来，我国也掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮，纳豆激酶的药用价值日益突出，在我国传统大豆发酵食品豆豉中发现了类似纳豆激酶的高活力的纤溶酶，将其产生菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，并将豆豉纤溶酶基因克隆到了毕赤酵母中。同样由枯草芽孢杆菌合成的聚谷氨酸也可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等。随着人们对枯草芽孢杆菌性质的深入，发现芽孢杆菌具有稳定性好、抗性强、7耐高温、耐酸碱[1]、抑制病原菌繁殖、产生多种酶类、提高动物消化酶活性、分解有机污染物、净化水质等优点，而被广泛应用于水产动物养殖中；于此同时枯草芽孢杆菌又可以产生微生物源性抗菌蛋白[2]；从而国内外研究者掀起对拮抗菌株的筛选、鉴定以及其抗菌物质理化特点等方面进行了大量研究工作的热潮，虽然在实际的应用中，大多停留在实验室等机构试验阶段，但它所展现的应用前景却十分广阔。枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低、芽孢形成率低等问题，