泛素蛋白酶体途径与癌症

USTB时国庆应用科学学院生物科学与技术系泛素-蛋白酶体途径与恶性肿瘤USTB主要内容泛素-蛋白酶体途径1泛素—蛋白酶体途径与癌症发生2蛋白酶体作为抗肿瘤药物靶标3问题与展望4USTB一、泛素-蛋白酶体途径蛋白质合成蛋白质降解USTBAaronCiechanoverAvramHershkoIrwinRose2004年,因“发现泛素介导的蛋白质降解途径”，来自以色列工学院的AaronCiechanover、AvramHershko和美国加利福尼亚大学欧文分校的IrwinRose分享了诺贝尔化学奖。USTB哺乳动物细胞中蛋白质的降解异常蛋白短周期蛋白内质网相关蛋白长周期蛋白膜蛋白细胞外蛋白泛素-蛋白酶体途径溶酶体途径氨基酸小肽80-90%10-20%USTB泛素-蛋白酶体途径在细胞分化、细胞繁殖、细胞凋亡、基因转录、信号传导、代谢调控、免疫监视等基本细胞生命过程中起关键作用。USTB泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin-ProteasomePathway，UPP）蛋白质降解去泛素化泛素活化泛素结合26S蛋白酶体小肽泛素目标蛋白DUBsUSTB泛素泛素是1975年由Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞内高度保守的多肽，单个泛素分子由76个氨基酸组成，分子量约8.5kD。泛素分子紧密折叠成球形，5股混合的β片层形成一个腔样结构。内部对角线位置有1个α螺旋，这个结构称为泛素折叠。这个小蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的C末端延伸部分，这个末端第76位含有一个必须的甘氨酸。泛素与其它蛋白都是通过C-末端第76位甘氨酸来连接的。MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGUSTB泛素活化酶（E1）E1是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶。E1是一种广泛表达的多肽，大约1100个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。E1有2个亚型，是由同一个mRNA在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。酵母的E1基因失活后是致命的，说明这个蛋白对于细胞的生存是至关重要的。E1可以水解ATP，与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素。E1具有高度的催化效能，在低浓度的情况下就能够激活泛素，满足下游的级联反应过程。USTB泛素结合酶（E2s）级联反应的第二步是泛素分子经过转硫醇反应从E1半胱氨酸残基转移给E2s活化的半胱氨酸位点。E2s在哺乳动物中至少有25个基因，所有的E2s都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域，在结构域的中央是决定E2s活性的半胱氨酸残基，位于蛋白表面浅的裂隙内。E2s家族中的一小部分成员只含有这个核心结构，但是其它的大部分成员还有N-或C-末端的延伸，这种结构可能与E3s的识别、E2s自身的活性以及底物识别有关。E1和E3s通过相同的基序与E2s连接，这说明在反应循环过程中，E2s必须在E1和E3s之间穿梭往返运行。因此为了保证在激活的泛素与数量巨大的E3s之间得到平衡的分布，需要多个E2s异构体。E2s/Ub非共价结合的亲和力非常低，说明其在转移泛素分子到靶蛋白上起着重要的作用。USTB泛素-蛋白连接酶（E3s）泛素化途径最重要的特征就是底物的多样性和选择性，这一功能由E3s直接决定。目前主要有3种类型的E3s，即含有HECT（homologoustoE6-associatedproteincarboxylterminus）结构域的E3s、含有环指状（RINGfinger）结构域的E3s和含有U-box结构域的E3s。在高等生物E3的总数从几百到一千以上，新的E3亚家族仍不断被发现。正是由于这些复杂多变的E3s家族成员可以对不同的底物进行特异性的识别，才呈现出蛋白降解的高度选择性。USTB泛素解离酶（DUBs）DUBs属于蛋白酶超家族，根据其催化机制，可以分为5类（天门冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶），生物信息学研究显示大约有79个有功能的DUBs，其中大部分为半胱氨酸蛋白酶。DUBs能够识别最接近的泛素基序，特异性地在泛素和与其C末端最后一个残基（Gly76）相连的分子之间断开。USTB26S蛋白酶体26S蛋白酶体是降解泛素化底物的一个ATP依赖型蛋白水解复合体，由20S核心蛋白酶（coreprotease，CP）和19S调节颗粒（regulatoryparticle，RP）构成。CP是由4个七聚体蛋白组成的环层叠在一起形成的一个空心圆柱体样结构（α1-7β1-7β1-7α1-7），是26S蛋白酶体的水解核心。活性位点位于20S圆柱体空心结构中心的2个β环上。2个α亚基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的入口，对蛋白酶体CP的活性具有自身抑制作用，这样只有进入蛋白酶体圆柱体内部的蛋白才能够被水解。RP由基底（Base）和盖子（Lid）两个亚单位组成，分别与CP两端的α环相结合。基底亚单位是由6个相关的AAA-ATPasesRPT1-6（regulatoryparticletriple-Aprotein）和3个non-ATPaseRPN（regulatoryparticlenon-ATPase）1、2和10组成的环状结构，能够活化20S核心颗粒。盖子亚单位含有其余的non-ATPase（RPN3、5-9、11和12），是泛素依赖性蛋白降解所必须的。USTB蛋白酶体结构26S蛋白酶体包括2个19S调控蛋白和一个20S核心蛋白USTB20S蛋白酶体至少有三种不同的蛋白酶活性已知的20S蛋白酶体蛋白酶活性至少有三种，催化位点均位于β亚基上，分别是：类糜蛋白酶活性（β5），类胰蛋白酶活性（β2），肽-谷氨酰肽水解酶活性（β1）USTBβ1、β2、β3亚基对多肽的水解依靠Thr1USTB二、泛素-蛋白酶体途径（UPP）与癌症发生1.UPP调控细胞周期与癌症发生细胞周期包括：G1期：第一个间期，主要进行细胞体积的增大,并为DNA合成作准备。不分裂细胞则停留在G1期。S期：DNA合成时期，染色体数目在此期加倍。G2期：DNA合成后至细胞分裂开始之前的第二个间期，为细胞分裂作准备。M期：细胞分裂期。G0期：离开细胞周期不再进行分裂的时期，也就是休息的时期。USTB蛋白酶体对细胞周期的调控USTBP27KIP1具有负反馈调节CDK2／CyclinE和CDK2／CyclinA复合体的作用，阻止细胞周期从G期进入S期，从而起到抑制细胞生长的作用。P27KIP1的表达受E3家族SCF和后期促进复合物（APC/C）两种蛋白酶的调控。在一些肿瘤中，SCF的Skp2亚基活性增加，从而使p27KIP1发生过度泛素化，而被蛋白酶体降解。由于p27KIP1的泛素化降解，下调了细胞内的p27水平，使细胞增殖异常加快，这可能是导致细胞癌变的重要原因。USTB2.UPP调控细胞凋亡与癌症发生细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。细胞凋亡是生物界广泛存在的一种基本生命现象，如同细胞生长、发育、增殖一样，起着十分重要的作用。UPP通过26S蛋白酶体降解一些与凋亡相关的蛋白，如转录因子，凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等，发挥调控细胞凋亡的作用。USTB2.1UPP对p53蛋白的调控p53蛋白是细胞内重要的凋亡调控因子，可通过激活一系列靶基因实现凋亡调控功能。MDM2是E3家族成员，促进p53从核内向细胞质转运，使之被泛素化后降解，从而发挥抗凋亡作用。多种肿瘤细胞中发现UPP活性上调，p53蛋白降解增加，肿瘤细胞增殖明显上升。USTB2.2UPP对转录因子NF-κB的调控细胞转录因子NF-κB可以激活抗凋亡基因如bcl-2等，发挥抗凋亡作用。正常情况下，NF-κB活性被IκB抑制。肿瘤细胞中参与IκB降解的蛋白酶体活性增加，细胞内NF-κB水平升高，细胞增殖增加。USTB三、蛋白酶体作为抗肿瘤药物靶标1、为什么蛋白酶体可以作为抗肿瘤药物靶标？大量实验研究显示，活跃增殖的恶性肿瘤细胞比正常细胞对蛋白酶体抑制剂更加敏感。CellDeathandDifferentiation(1998)5,1062-1075USTB对第一个进入临床实验的药物Bortemib的毒理观察显示，该药物毒副作用是可控的。AnnalsofOncology17:813–817,2006USTB肿瘤细胞对蛋白酶体抑制敏感，而正常细胞不敏感的机理尚不清楚，目前猜测可能与如下因素有关：癌细胞处于快速的增殖中，并且存在一个或多个细胞周期检控点（checkpoint）异常，这导致缺陷蛋白的积累速度高于正常细胞，因此更需要蛋白酶体作为一种蛋白降解途径。蛋白酶体活性的抑制可以修复某些细胞周期及凋亡检控点的突变因子，使失控的细胞增殖被抑制。转录因子NF-κB途径的抑制USTB三、蛋白酶体作为抗肿瘤药物靶标2、作为抗肿瘤药物的蛋白酶体抑制剂2.1硼替佐米（bortezomib,PS-341）是首个被美国FDA批准用于临床的蛋白酶体抑制剂，用于治疗复发性、难治性多发性骨髓瘤。作用位点：特异性抑制蛋白酶体的类糜蛋白酶活性（β5亚基）。USTB硼替佐米临床实验结果USTB硼替佐米临床实验结果USTBJOURNALOFCLINICALONCOLOGY,2005,23,230-239蛋白酶体抑制对骨髓瘤细胞及其微环境的影响USTB2.2、EGCG及其衍生物(-)-EGCG是一种从绿茶中提取的天然多酚类化合物。Dou等证明(-)-EGCG可以抑制蛋白酶体的β1亚基和β5亚基蛋白酶活性。人工合成的含酯键的衍生物具有类似的抑制活性。JBiolChem2001;276:13322–13330.USTB将EGCG与β5亚基进行分子对接（docking）,发现EGCG可以很好的嵌入到β5亚基的活性位点。PROTEINS，54:58–70(2004)USTBEGCG与β5亚基的结合可能来源于2种作用：1）Thr1上的OH与EGCG上的羰基C形成半缩醛；2）EGCG的AC环与β5亚基的S1口袋有较强的疏水相互作用。PROTEINS，54:58–70(2004)USTB为提高细胞对EGCG的摄取及EGCG在细胞中的稳定性，对EGCG的羟基进行了酰基化保护。CancerRes2007;67:(9),4303-4310USTBCancerRes2007;67:(9),4303-4310USTBCancerRes2007;67:(9),4303-4310USTB2.3、醉茄素A(withaferin-A)MolPharmacol71:426–437,2007USTBMolPharmacol71:426–437,2007USTBMolPharmacol71:426–437,2007USTB2.4、金属有机化合物许多肿瘤细胞富含铜。无毒的有机配体进入细胞后与铜结合生成蛋白酶体抑制剂。对肿瘤细胞更高的选择性BreastCancerResearch2005,7:R897-R908USTBBreastCancerResearch2005,7:R897-R908CQ+Cu和PDTC+Cu对MCF10细胞凋亡的诱导。（a）正常乳腺细胞MCF10A；（b）癌变前乳腺细胞MCF10AT1K.cl2；（c）癌变乳腺细胞MCF10DCIS.comUSTBBreastCancerResearch2005,7:R897-R908CQ+Cu和PDTC+Cu对正常乳腺细胞MCF10A和癌变乳腺细胞MCF10DCIS.com中蛋白酶体活性的影响。USTBBreastCancerResearch2005,7:R897-R908癌变前细胞MCF10AT1K.cl2和乳腺癌细胞MCF-MDA-231细胞均可富集与病人组织相近浓度水平的Cu，并被CQ和PDTC