第一章酶工程绪论

酶工程Enzymaticengineering唐良华福建师范大学生命科学学院工业的发展与环境问题n工业革命–初始阶段n•巨大的环境污染n•极大地改变了环境n•对生态系统造成了不可逆的破坏n工业发展到一定阶段–最近几十年n•污染被控制n•更关注于资源的利用效率n但n•环境污染还在继续！nWebelievethatenzymetechnologyhasagoodnopportunityfordoingthis酶学及酶的主要特性n酶是生物催化剂-proteins,thathelpchemicalreactions.n在活细胞内所发生的反应都是由酶来催化完成的n对酶的利用其实就是开发和利用自然界原本就存在的技术n酶的主要特性：n•具有高度特异性；n•作用条件温和，需要的量很少；n•完全生物可降解；n•可以由可再生的物质生产获得；n•可应用的领域很多。酶的应用洗毛工艺中蛋白酶的应用生产中经常会发现,洗净毛色泽黯沉,影响后加工的质量和成品的色光。国内外学者研究发现,原毛表面除了含有羊毛脂、羊汗、土杂、草屑污染物外,还存在另一种蛋白质污染物(PCL),它的残存使洗净毛色泽黯沉,采用传统的洗毛方法很难完全去除。为洗除羊毛表面的蛋白质污染物,在洗毛工艺中应用AS1398中性枯草杆菌蛋白酶,可提高洗净毛的质量。淀粉酶—可用于制备高果糖浆纤维素酶---分解植物秸杆，生成葡萄糖葡萄糖可以进一步通过酵母的发酵生成乙醇（生物酒精）脂肪酶广泛用于化妆品、食品、医药、洗涤剂工业中的生物表面活性剂包括脂肪酸单甘油酯、脂肪酸糖酯、聚甘油脂肪酸酯和长链脂肪酸蜡酯。传统化学法以碱为催化剂在高温下进行,不仅能耗高且产品纯度低。脂肪酶作为一种天然生物催化剂,可在温和条件下催化合成上述生物表面活性剂,能耗低且产品纯度高。医药生产用酶青霉素酰化酶青霉素酰化酶是一种能转化天然青霉素的酶.它水解苯乙酸和一些密切相关的芳香脂肪酸的酰胺.在适当条件下,它还能催化6-氨基青霉烷酸生成半合成青霉素.可获得高效、广谱、服用方便的半合成抗生素,由于这些抗生素在临床上广泛的应用,从而使青霉素酰化酶的需要量日益增长.青霉素酰化酶常由微生物产生,分胞内酶及胞外酶两种形式.酶工程n酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。酶工程的研究范围（1）对自然界中存在的天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。n尽管人类19世纪前后才建立起酶的概念，但酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用。比如：(1)在人类游牧生活时期，就已会利用动物的胃液来凝固牛乳；(2)人类在4000多年前就已掌握的酿酒和制酱技术其实也是酶作用的结果。酶工程的发展简史1887年以后，Bucher发现酶的细胞外作用现象，从而导致了酶的发现与相关研究的开始。最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等。之后，Takamine利用霉菌等微生物来生产淀粉酶，这使得酶制剂工业取得突破，其方法至今仍被采用。第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。20世纪90年代，随着基因工程技术的广泛应用，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程＋发酵工艺＋先进的发酵设备”可以算是酶工业的一次飞跃。酶的基础知识一什么是酶？Enzyme：酶是由具有催化活性的蛋白质（包括abzyme）、DNA、RNA。二酶催化特性n高效率比无催化高108－1020倍比化学催化剂高107－1013倍n高度专一性n反应条件温和n酶催化活性是可调控的☆酶作用专一性的类型n专一性：一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键n1.立体化学专一性n1)立体异构专一性(L/D)n2)几何异构专一性(顺/反)n2.非立体化学专一性n1)键专一性:A-Bn2)基团专一性:A-B,A-Bn3)绝对专一性:A-B酶作用专一性的机制☆诱导契合学说n该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.三酶的化学本质n蛋白质nRNADNA抗体酶四酶的组成简单酶酶结合酶辅酶Coenzyme辅因子辅基Prostheticgroupn(1)习惯命名法:n1,根据其催化底物来命名；n2,根据所催化反应的性质来命名；n3,结合上述两个原则来命名，n4,有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。1.酶的命名五酶的命名与分类五酶的命名与分类习惯命名法：1.根据酶所用的底物来命名核糖核酸酶蛋白酶2.根据所催化的反应来命名脱氢酶磷酸基团转移酶氨基转移酶3.上述两个原则结合葡萄糖氧化酶3.上述原则再加上酶的来源牛胰核糖核酸酶国际系统命名法n系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。n例如：n习惯名称:谷丙转氨酶n系统名称:丙氨酸：a-酮戊二酸氨基转移酶n酶催化的反应:n谷氨酸+丙酮酸¾®a-酮戊二酸+丙氨酸2.酶的分类1.氧化还原酶类Oxidoreductases2.转移酶类Transgerases3.水解酶类Hydrolases4.裂合酶类Lyases5.异构酶类Isomerases6.合成酶类SynthetasesSynthases2.酶的分类n水解酶催化底物的加水分解反应。n主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。nAB+H2O→AOH+BHn例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(1)水解酶hydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH2.酶的分类n氧化-还原酶催化氧化-还原反应。n主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。n如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(2)氧化-还原酶OxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH2.酶的分类n转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(3)转移酶TransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO2.酶的分类n裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。n主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。n2→1或1→2,A+BABn例如，延胡索酸水合酶催化的反应。(4)裂合酶LyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH2.酶的分类n异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)异构酶IsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH2.酶的分类n合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。nA+B+ATP+H-O-H===A¾B+ADP+Pin例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2®草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase3.辅酶coenzyme和金属离子n根据酶的组成情况，可以将酶分为两大类：n单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质.n结合蛋白酶：某些酶，例如氧化-还原酶等，其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分.n结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶及金属离子(或辅因子cofactor)。n酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。单纯的酶蛋白无催化功能.B族维生素与辅酶辅酶在酶促反应中的作用特点n辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。n每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。n同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。n一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。酶分子中的金属离子n根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：金属酶和金属激酶。n在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3+、Zn2+、Mn2+、Co2+等。n金属酶中的金属离子作为酶的辅助因子，在酶促反应中传递电子，原子或功能团。金属酶中的金属离子与配体n金属离子配体酶或蛋白nMn2+咪唑丙酮酸脱氢酶nFe2+/Fe3+卟啉环，咪唑，血红素，含硫配体氧化-还原酶，过氧化氢酶nCu+/Cu2+咪唑，酰胺细胞色素氧化酶nCo2+卟啉环变位酶nZn2+-NH3，咪唑，（-RS）2碳酸酐酶，醇脱氢酶nPb2+-SHd-氨基-g-酮戊二酸脱水酶nNi2+-SH尿酶金属激酶中的金属离子n激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。n其中的金属离子与酶的结合一般较松散。在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。n如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等。金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。3.7重要的酶类n1.单体酶n寡聚酶n多酶体系n2.同工酶:催化相同的化学反应但分子结构不同的一类酶.存在于不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中.在生理上、免疫上、理化性质上存在很多差异.如LDH1～LDH5n3.结构酶n诱导酶4.调节酶n一般催化代谢反应链中的单向反应或速度最慢的步骤,因而可调节、控制反应链的总的方向和总速度.n调节酶一般位于代谢反应链的开端或分枝点上。n1)共价调节酶n调节剂通过共价键与酶分子结合,以增减酶分子上的基团来改变酶的活性(高/低,有/无).n共价修饰的方式:磷酸化/去磷酸化,乙酰化/去乙酰化,n腺(尿)苷化/去腺(尿)苷化,甲基化/去甲基化,n-S-S-/-SH5酶的结构n1．结合部位Bindingsiten酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。（一）酶分子的结构特点n酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。n通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。n结合部位决定酶的专一性，n催化部位决定酶所催化反应的性质。2．催化部位catalyticsiten酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。3．调控部位Regulatorysiten主要包括：n亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNH酶活性中心的必需基团n酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。H2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH6.酶的作用机制n一、中间产物学说n在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。nE+S====E-S¾¾®P+En许多实验事实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。n酶促反应：E+S===ES===ES¹n¾®EP¾®E+Pn反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化DH°。n而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。n催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用二、活化能降低n酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反