乙型肝火病毒粒子的包装过程

原文：EnvelopmentofthehepatitisBvirusnucleocapsid作者：VOLKERBRUSS作者单位：DepartmentofMedicalMicrobiology,UniversityofGottingen,D-37075Gottingen,Germany发表刊物：VirusResearch106(2004)199–209以下为中文翻译稿：乙型肝炎病毒核壳的包膜化过程摘要：乙型肝炎病毒（HBV）是一种二十面体的有包膜的DNA病毒，其复制具逆转录过程。HBV衣壳的晶体结构也已经阐明，其组分为有一种蛋白（C蛋白）构成，衣壳直径为36nm。病毒的包膜含有三种多次跨膜的蛋白（S，M和L蛋白），并且这些蛋白有着共同的C端。这些包膜蛋白不仅作为病毒包膜的组分从感染的细胞中释放，大多数还组装成一种直径22nm的不含衣壳的亚病毒脂蛋白颗粒从细胞中释放，它的量超过所需的一万倍。病毒衣壳的组装发生在胞质中，3.5kb的RNA分子及一些病毒和细胞因子也被一起包装进去。这种新形成的衣壳不能被有效包膜进去。在衣壳腔体内的病毒DNA基因组的逆转录合成的发生需要形成一种出芽复合物的状态。包膜化过程发生在高尔基前体复合物的结构中。这个过程需要S和L蛋白，而不需要M蛋白。L蛋白形成两个不同的跨膜结构。在细胞质一侧的膜上，此蛋白N一端一部分的异构是形成出芽结构必需条件。在这个区域，一个长22个氨基酸的区段的遗传学图谱已经完成，被证实是在形态发生过程有着重要作用。这个区域大概介导了与衣壳的联系。第二个结构域是在S蛋白的细胞质侧的环状区域。一个相似的基因特征在两小的衣壳白表面区域被发现，它大概还介导了在包装过程中与包膜蛋白的相互作用。前言：乙肝病毒是嗜肝DNA病毒科的代表种，这个科由一小类有包膜的DNA病毒组成，它们为二十面体结构，在特异性宿主的肝细胞中经过逆转录过程复制(GanemandSchneider,2001)。这个科的一些成员可以感染哺乳类，例如土拔鼠肝炎病毒（WHV），或者鸟类，例如鸭乙肝病毒（DHBV），此病毒作为了重要的乙肝感染研究模型。病毒DNA基因组相对较小（大约3kb），它仅有4个（为哺乳类病毒），或3个（为鸟类病毒）开放阅读框（见图1）。因此，嗜肝DNA病毒颗粒仅由少数不同的病毒蛋白组成，一种蛋白形成衣壳外层蛋白，一种形成逆转录酶，另外两种或三种蛋白则构成包膜组分。这些少量的结构蛋白使肝炎病毒成为了一种在研究二十面体病毒包装过程中相当适合的模型(Nassal,1996)。图1.乙型肝炎病毒基因组。长3221bp的环形HBV基因组，带有4个开放阅读框（黑粗线表示），分别为C、E、P和X。它们编码衣壳蛋白、结构蛋白、逆转录酶和一种调节蛋白。白色箭头表示起始密码。启动子（C、PS1、PS2和X）用黑色箭头表示，单一的Poly（A）加尾信号用长方盒表示。开放阅读框E产生三个同尾蛋白（S、M和L），用细线表示。包膜蛋白区域前体S1、S2和S也在图中标示。乙肝导致了人类肝脏的感染和发炎(HollingerandLiang,2001)。在世界范围内，超过3亿的人是乙肝携带者。病毒的传播依靠亲本的途径，例如母亲生产婴儿，通过静脉的吸毒方式以及性交过程。不仅仅因为它们在医疗中的重要作用，而且因为它们独特的生物学和小的基因级结构，嗜肝DNA病毒在过去被广泛研究。在研究过程中遇到的主要障碍是缺少感染乙肝的小的实验动物模型，一直到现在，也还是缺少一种有感染性的细胞系(Griponetal.,2002)。庆幸的是，来自于肝癌细胞的细胞系，例如HepG2和Huh7，当它们转染进病毒基因组后可以产生感染性的病毒颗粒(Acsetal.,1987;Yaginumaetal.,1987)。因此，嗜肝DNA病毒可以在体外进行形态学研究，然而，乙肝病毒的产量还是相对较低。大概估计，每天每个肝细胞在体外感染期间释放出1到10个病毒粒子(Nowaketal.,1996)。在体外这些数量并不会明显提高。因此，通过电镜观察乙肝的出芽是非常困难的(RoingeardandSureau,1998)。下面是关于乙肝复制的一个简略的回顾(GanemandSchneider,2001)，嗜肝病毒的感染早期并不是十分清楚，直到现在，仅DHBV的一个分子受体被发现和阐述，其它的都还是不十分地确定(Urbanetal.,2000)。这个蛋白，然而在其它的一些细胞中并没有表现出一种持续的侵染状态。在进入到细胞质后，核衣壳被转运到细胞核中并释放出部分双链DNA基因组到核中(Rabeetal.,2003)。病毒的DNA被宿主因子修复成完整的双链DNA复合物。四个部分重叠的开放阅读框为哺乳动物嗜肝病毒基因组编码的蛋白，依次为衣壳蛋白C，包膜蛋白，表现出多种功能的有逆转录酶活性的蛋白P和一种调节蛋白X（见图1），在鸟类肝炎病毒中，基因X是缺失的。双链DNA复合物通过宿主因子，利用哺乳动物病毒中的4个起动子和一个PloyA尾加尾位点完成转录。乙肝蛋白C和P的翻译起始于启动子C处，位于独一天二的病毒基因组加尾信号上游约100bp处。这个信号在第一个扫描机制中被忽略，在第二次的时候产生一个没有切割完成的未端冗余RNA分子（超基因组RNA分子）。基因C转录的位置靠5´端非常近，并被翻译成蛋白C。另外，这个转录的mRNA翻译的产物为蛋白P，它来自于下游的第二个开放阅读框。转录起始于启动子C，在mRNAC的上游一点点处，它形成前体C。蛋白C的翻译延伸，并在N端产生一个分泌的信号肽。这个信号使前体的蛋白C进入内质网腔中，在N端和C端进行蛋白的可溶性加工，并最后分泌出可溶的蛋白，形成乙肝的抗原e结构。蛋白C的前体不参于病毒的复制，也不参于病毒的形成和感染(Changetal.,1987;Schlichtetal.,1987)。它可能作为感染的宿主中的免疫调节因子(Milichetal.,1998)。亚基因组的转录并翻译成3个包膜蛋白（见下）和蛋白X。蛋白P接合于前体的超基因组核心的RNA，位于包装信号处，这个复合物产生的核衣壳蛋白包裹，在衣壳中，通过反转录形成病毒的DNA基因组(SummersandMason,1982)。第一步，（+）链RNA被反转录成单链的（－）DNA，之后随即被降解。第二步，（－）DNA作为模板合成（+）DNA。在这个过程中，基因组被球化。（+）链在衣壳中并没有完成，因此，基因组包含着一个单链的缺口。核衣壳此时可以返回到细胞核中并释放基基因组到核质中，完成基因组的扩增(Tuttlemanetal.,1986)，或者衣壳在细胞内的后－内质网和前－高尔基体中形成包膜，作为成熟的病毒颗粒分泌到细胞外。包膜化过程直接依赖于包膜蛋白和衣壳蛋白的相互作用。在以下的部分中，将讨论亚状态乙肝的出芽过程。乙肝衣壳和跨膜的包膜蛋白及病毒的亚结构的相互作用，本文的大多数介绍来自于人类乙肝的研究，还有一些来自于动物的嗜肝DNA病毒。2、乙肝衣壳蛋白乙肝的二十面体衣壳蛋白由多拷贝的蛋白C组成，不同基因型的拷贝数为183或185个氨基酸。在不同的细胞系中，此蛋白都能有效地表达，例如在细菌、酵母、蛙卵细胞和哺乳动物细胞，并且在这些细胞系中，在没有其它乙肝复合物的存在下可以自我组装成为衣壳结构。组装开始于同源二聚体的形成(ZhouandStandring,1992)，在第61位的半胱氨酸处形成二硫键(Nassaletal.,1992;Zhengetal.,1992)。蛋白C的复合物包含有分子伴侣，已经被发现但还没有详细的细节报告(Lingappaetal.,1994)。最终的病毒衣壳来自于相当弱的内部二聚体相互作用(CeresandZlotnick,2002)。颗粒表现出二种的类型(Crowtheretal.,1994)：一种为直径30nm由90个二聚体组成，为T=3的对称结构，另一各种为较大一点的直径为34nm，由120个二聚体组成的为T=4的对称结构。这两种结构在感染的人类肝细胞中也被发现(Kenneyetal.,1995)。但是，哪种衣壳存在于感染的病毒中还不是很清楚。蛋白C的C末端氨基酸大约一半为精氨酸。这个区域和精蛋白的相似，涉及到前体基因组和逆转录复合物的包装。在有蛋白P和前体基因组存在时异源性表达核心蛋白，非特异性的宿主的RNA被包装到衣壳内。如果精氨酸富积区域被缺失，核酸的包装则不会发生，但是核心衣壳颗粒仍会有效地形成(Gallinaetal.,1989)。在大肠杆菌中，缺失C末端的缺失体会产生大量的较大的颗粒(Zlotnicketal.,1996)。这种材料适合让拆叠的蛋白C在低分辨率的电镜下进行观察(Bottcheretal.,1997;Conwayetal.,1997)，并最终进行了分辨率为3.3Å的观察(Wynneetal.,1999)。从衣壳蛋白外表面看，二聚体是现出向外垂直的菱形的形态（见图2）。这个突触的尖端多肽形成了衣壳抗原（HBcAg）。5个和6个二聚体在5重轴和准6重轴处分别排列，和轴相对的菱形成一定角度，衣壳表面呈网状结构，有直径12-15Å的小孔，可以允许核酸自由进出衣壳的内部。图2.C端截短的乙型肝炎病毒衣壳蛋白C的二聚体晶体结构（Wynneetal.,1999）。突触在图的右上方，衣壳蛋白腔体将在图的下方。52个暴露在衣壳表面的氨基酸单个置换成丙氨酸的突变表明，每个单体中的11个残基（黑球表示）的突变对于衣壳形成、病毒DNA在颗粒体内的合成都没有影响，但会阻断核衣壳的包膜化）（PorselandBruss，2003）。这些区域可能是出芽过程中与包膜发生相互作用的结合位点。这个精氨酸富积区不存在于晶体结构中，被认为是在病毒颗粒腔体中与病毒核酸相互作用造成的(Zlotnicketal.,1997)。然而，一个单克隆抗体可以直接作用于C蛋白的这个区域到乙肝病毒衣壳上(Machidaetal.,1991)，胰蛋白酶可以从重组的乙肝衣壳上截断大约一半的蛋白C(Lieder,2002)。因此，似乎蛋白C的精氨酸富积区位于衣壳腔体内，但蛋白C的另外一些区域则位于衣壳的外表面一侧。在乙肝感染的细胞中，衣壳的组装是和结合有病毒P蛋白的病毒前体RNA基因组一起进行的(BartenschlagerandSchaller,1992;Hirschetal.,1990)，并且有像分子伴侣之类的细胞因子参与(BeckandNassal,2003;Wangetal.,2002)，并且有在精氨酸富积区的丝氨酸蛋白激酶的磷酸化(Daubetal.,2002;KannandGerlich,1994;KauandTing,1998)。这个包装过程在低浓度的蛋白C得二聚体条件下进行，低于仅仅来自于C蛋白(Seiferetal.,1993)的衣壳形成时的浓度，这使前体基因组和复制因子进行有效地包装。近来发现一种低分子量复合物通过结合感染乙肝的蛋白使乙肝基因组核心蛋白不稳定，并且它还阻止衣壳的形成(Deresetal.,2003)。已经有了可能潜在的抗病毒药物在将来作用于慢性乙型肝炎。衣壳的解体也能被非抑制细胞的通路的α肿瘤坏死因子诱导，并且在自然感染的抗病毒机制中有着重要作用(Biermeretal.,2003)。3、衣壳的成熟过程当乙肝核衣壳形成后，它包含有一个RNA分子（前体基因组），然而分泌型的病毒粒子则包含有部分双链的环形的DNA，此DNA分子来自于病毒粒子腔的逆转录过程。实际上，在感染的细胞中可以发现有病毒DNA的合成，而在病毒粒子中则没有(Masonetal.,1982;Weiseretal.,1983)。因此，可以推测，不成熟的，含有RNA的衣壳在出芽过程中被排除，病毒DNA的合成是和衣壳的结构变化相联系的，只有成熟的衣壳结构才能有包膜的形成(SummersandMason,1982)，这个模型得到了实验的支持。许多在C端截短的DHBV核心蛋白在先于形成部分环状的双链DNA时阻止核酸的合成，同样也抑制衣壳的包膜化过程(YuandSummers,1991)。当对HBV和DHBV逆转