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LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测LDH释放检测方法:a.根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中,使待检测时细胞密度不超过80-90%满。b.吸去培养液,用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液),将各培养孔分成如下几组:包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔),未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔),未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔),以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔),并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理(如加入0-10μl左右特定的药物刺激,可设置不同浓度,不同处理时间,对照孔中需加入适当的药物溶剂对照),继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时,从细胞培养箱里取出细胞培养板,在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂,加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后,反复吹打数次混匀,然后继续在细胞培养箱中孵育。c.到达预定时间后,将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相应孔中,随即进行样品测定。准备工作:a.INT溶液(1X)的配置:根据所需的INT溶液(1X)的量,取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如,取20μlINT溶液(10X),加入180μlINT稀释液,混匀后即配置为200μlINT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用,配置后4℃保存可于当天使用,不宜配置后冻存。b.LDH检测工作液的配制:根据待测定的样品数(含对照),参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。注意:LDH检测工作液必须现配现用,配制和使用过程中均要注意适当避光。样品测定:a.各孔分别加入60μlLDH检测工作液。b.混匀,室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100d.可绘制细胞毒性曲线:纵座标为实际吸光度,横坐标为药物浓度;据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。
本文标题:LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
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