氨基酸的定量测定

氨基酸的定量测定一、氨基酸的一般定量测定1、甲醛滴定法2、电位滴定法3、茚三酮比色法4、非水溶液滴定法5、邻苯二甲醛法6、三硝基苯磺酸法7、乙酰丙酮法二、个别氨基酸的定量测定1、赖氨酸的测定2、色氨酸的测定3、苯丙氨酸的测定4、酪氨酸的测定5、脯氨酸的测定6、羟脯氨酸的测定7、胱氨酸的测定8、谷氨酸的测定一、氨基酸的一般定量测定1、甲醛滴定法原理：氨基酸具有酸性的羧基（—COOH）和碱性的氨基（—NH2），它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定—COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。1、甲醛滴定法特点：简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近应用：脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高试剂：40%中性甲醛溶液（以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液将40%甲醛中和至淡蓝色）1g/L百里酚酞乙醇溶液1g/L中性红50%乙醇溶液0.1mol/L氢氧化钠标准溶液1、甲醛滴定法操作方法：吸取含氨基酸20~30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中一份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥珀色为终点；另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的氢氧化钠标准溶液体积。1、甲醛滴定法计算结果：氨基酸态氮含量=式中：c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/LV1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mLV2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mLm——测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014——N2毫摩尔质量，g/mmol%100014.0)(12mcVV211、甲醛滴定法注意事项：①此法适用于测定食品中的游离氨基酸②固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。③若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。④与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和—COOH时的pH为8.5~9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。2、电位滴定法原理:根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH判断滴定终点。仪器：酸度计磁力搅拌器微量滴定管试剂：20%中性甲醛溶液0.05mol/L氢氧化钠标准溶液2、电位滴定法操作方法：吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL），供计算总酸含量。加入10.0mL甲醛溶液，混匀，再加上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）。同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8.2，再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。2、电位滴定法结果计算：氨基酸态氮含量=式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mLV2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mLc——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/Lm——测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014——N2毫摩尔质量，g/mmol%100100/20014.0)(21mcVV212、电位滴定法说明：①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定②浑浊和色深样液可不经处理而直接测定3、茚三酮比色法原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为750nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。仪器：可见分光光度计试剂：①20g/L茚三酮溶液②pH8.04磷酸盐缓冲溶液③氨基酸标准溶液（200μg/mL）3、茚三酮比色法操作方法：①标准曲线绘制：准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600μg氨基酸），分别置于25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮和磷酸盐缓冲溶液各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。②样品测定：吸取澄清的样品溶液1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸质量。3、茚三酮比色法结果计算：氨基酸含量=（mg/100g）式中：m——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，μgm1——测定的样品溶液相当于样品的质量，g10010001mm注意事项：①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品5～10g或吸取样液样品5～10mL置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法如下：取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1分钟，静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。3、茚三酮比色法4、非水溶液滴定法原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈现中性，假如在冰醋酸中就显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。本法适用于氨基酸成品的含量测定，允许测定的范围是几十毫克的氨基酸。4、非水溶液滴定法操作方法：①直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg左右，溶解于20mL冰醋酸中，加两滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定，终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸，滴定至同样终点颜色。氨基酸含量=式中：VHClO4——所消耗的高氯酸标准溶液的体积cHClO4——所消耗的高氯酸标准溶液的浓度M——被测氨基酸的摩尔质量m——被测氨基酸的质量%10044mMcVHClOHClO4、非水溶液滴定法②回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品30~40mg左右，溶解于5mL高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。氨基酸含量=（含有两个氨基的氨基酸，如赖氨酸、胱氨酸和精氨酸在此计算式中还应该除以2）式中：VHClO4——所消耗的高氯酸标准溶液的体积cHClO4——所消耗的高氯酸标准溶液的浓度VNaAC——所消耗的醋酸钠溶液的体积cNaAC——所消耗的醋酸钠溶液的浓度M——被测氨基酸的摩尔质量m——被测氨基酸的质量%100)(44mMcVcVNaACNaACHClOHClO4、非水溶液滴定法注意事项：(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。5、邻苯二甲醛法（OPT法）原理：邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340和455nm。各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法高100倍以上，可测到mol氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。410)1~1.0(5、邻苯二甲醛法（OPT法）操作：以血清中游离氨基酸测定为例。血清的去蛋白处理：血清或肝素血的血浆加等体积0.6mol/L三氯醋酸，混匀，静置10min后，3000~4000r/min离心10min。取上清液用水稀释5倍，相当于原血清的10倍稀释液。分别吸取：每组两份。①测定管：稀释10倍的血清上清液100μL，加水至300μL②标准管：1mmol谷氨酸标准溶液25μL，加0.06mol/L三氯醋酸100μL。加水至300μL③空白管：0.06mol/L三氯醋酸100μL，加水至300μL。分别加3mLOPT溶液于上述样品中，迅速摇匀，立即进行荧光测定。使用荧光分光光度计，激发光波长340nm，发射光波长455nm。6、三硝基苯磺酸法原理：三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。中间络合物在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355nm和420nm附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm处的吸收值显著下降，而350nm附近的吸收峰则移至340nm处。利用TNBS与氨基酸反应的这一特性，可在420nm处（偏碱性溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。在340nm处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm处的吸光度因氨基酸种类而异；在加入适量时，吸收值升高。本法允许的测定范围是0.05～0.4μmol氨基酸。23SO6、三硝基苯磺酸法操作方法：①偏碱性溶液，测420nm处吸光值。待测氨基酸样品溶液1mL，加40g/LNaHCO31mL、1g/LTNBS1mL、0.01mol/LNa2SO31mL，混合后于40℃反应2h，在420nm处测定。空白以蒸馏水代替待测液。标准曲线制作：标准氨基酸溶液0.1~0.8mL，补充水至1mL，与上述样品同样操作步骤。②偏酸性溶液，测340nm处吸光值。待测氨基酸样品溶液1mL，加40g/LNaHCO31mL、1g/LTNBS1mL，混合后于40℃反应2h，加1mol/L盐酸1mL，混合后在340nm处测定。空白以蒸馏水代替待测液。标准曲线制作：标准氨基酸溶液0.1~0.8mL，补充水至1mL，与上述样品同样操作步骤。7、乙酰丙酮和甲醛荧光法原理：氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。试剂：混合试剂：取1mol/L乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶