模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

LOGO模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定2012.11.2812012.11.28目录拟南芥的栽培拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定实验设计思路和原理22012.11.28实验设计的思路和原理经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。实验材料拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；种子多，每株每代可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。32012.11.28突变体的获得插入诱变（insertionalmutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中，获得突变体。当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。农杆菌转化法：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，可通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。42012.11.28模式植物拟南芥拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。52012.11.28AT1G69120基因AT1G69120基因即APETALA1，已有实验证明AT1G69120是拟南芥花分生组织特征基因。研究AT1G69120在花发育中的网络调控及其生物学功能。获得插入T-DNA的APETALA1突变体。利用反向遗传学方法进行研究。通过对突变体的突变性状与野生型拟南芥生长发育以及生理特征进行比较，可以获得拟南芥AT1G69120基因影响生物生理功能的相关信息。62012.11.28拟南芥突变体的获得打开NCBI主页：打开的页面如下：在上面的search内查找基因名称APETALA1：从上面可以看到一共有19个结果，其中第一个是拟南芥中的，点击AP1：根据上面的信息我们可以得到基因在拟南芥内的系统名称：AT1G6912072012.11.28查找基因AT1G69120打开SALK主页：打开的页面如下：点击T-DNAExpress：输入基因名称AT1G69120，点击search：82012.11.28查找基因AT1G69120从上述窗口中可以获得很多不同的突变体，专找SALK_冠名的那些，获得比较方便且便宜，有利于插入突变体。比如选择的是SALK_151561.52.85.n点击上面红圆圈内的SALK_151561.52.85.n可以从上面找到T-DNA的侧翼序列、所有的载体序列以及订购方式等。92012.11.28查找种子打开NASC打开的页面如下：输入上面选择的SALK_151561.52.85.n，寻找合适的种子序号：N57925102012.11.28突变体引物查询进入SIGnAL网站打开的页面如下：点击iSectTools进入:点击第一个选项1、SIGnALT-DNAVerificationPrimerDesign进入112012.11.28在这个网页里可以从上面的一些文字得到常用中间引物的序列，在下面的输入框里输入SALK_151561.52.85.n号后，即可得到左侧和右侧的引物：突变体引物查询也即：SALK_151561.52.85.nPRODUCT_SIZE1170PAIR_ANY_COMPL0.00PAIR_3'_COMPL0.00DIFF_TM0.55LPTCTAGGAAATCGATCGGGTTCLen21TM60.40GC47.62SELF_ANY_COMPL0.553'_COMPL0.00RPGAGAGCATGTAAGGATGCTGGLen21TM59.85GC52.38SELF_ANY_COMPL0.553'_COMPL0.00Insertionchr125983634BP+RP_PRODUCT_SIZE610-910122012.11.28132012.11.28拟南芥的栽培一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使种子在湿润条件下春化2至3天。二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。142012.11.28图片152012.11.28图片162012.11.28图片172012.11.28拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法一.提取植物DNA；二.PCR反应；三.琼脂糖凝胶电泳；182012.11.28一.提取植物基因组的过程1.植物细胞具有细胞壁，提取植物DNA首先要在液氮中将新鲜或冷冻的植物组织研磨成粉，使细胞壁破裂。2.加入含去污剂（如SDS、CTAB等）、螯合剂EDTA等成份的提取缓冲液，处理组织匀浆。去污剂裂解细胞膜，变性蛋白，使DNA释放到提取液中；EDTA则能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，而不能降解从核中释放的DNA。3.用氯仿-异戊醇除去组织匀浆中的变性蛋白质，如需要还可以用RNase去除RNA。4.用乙醇或异丙醇沉淀DNA。192012.11.28提取植物DNA的步骤1.从某植株上取2个幼嫩叶片，置于一个1.5ml离心管中，放于试管架上，加入液氮，用研棒研磨成细粉，加入600μL的2×CTAB提取液，轻摇混匀。2.65℃水浴0.5h，其间轻摇混匀。3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10min，然后12000rpm离心15min，再转移上清入新管中。4.向上清液中加2倍体积的无水乙醇，小心混匀。-20℃放置30min，12000rpm离心15min，弃上清。5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm稍离心，弃上清。6.将沉淀再空气中晾干10min或37℃烘箱中3-4min。加20μLTE(pH8.0)室温溶解。-20℃保存。2012.11.28二.PCR反应（变性--退火--延伸）1.按如下方法配制PCR反应体系（管上应写明株号）：10xTaqbuffer（Mg2+free）2ulMgCl22ul某株号模板DNA2ul引物LP0.5ul引物RP0.5ul引物BP0.5uldNTP0.5ulTaq酶0.2ulH2O11.8ul总体积20ul2.PCR程序：94℃变性5min；94℃变性40s，53℃复性50s，72℃延伸80s，共35个循环；72℃最终延伸10min；10℃保持。3.PCR结束以后，将样品拿出，检查管上的标号是否清晰，电泳检查结果。20212012.11.28三.琼脂糖凝胶电泳1.用0.5XTBE电泳缓冲液配置1％琼脂糖凝胶；2.在15uLPCR产物中加3uL上样缓冲液(6x)点样于1%琼脂糖胶上电泳,稳压100Ｖ（5Ｖ/cm）；3.电泳结束，溴化乙锭染色5分钟（如果电泳凝胶中不含溴化乙锭）；4.在紫外灯下或用凝胶成像仪观察、拍照，然后分析条带。LOGO