石蜡切片制作方法

石蜡切片用途：1.研究植物组织内部结构；2.原位杂交，揭示基因在植物体的表达部位或者特定的发育时期；3.组织化学，显示细胞内的某些化学成分（核酸，多糖，淀粉，脂肪，木质素等）。制作步骤：Day1取样固定FAA固定液固定：真空抽气30min，室温下24h，4℃存储。目的：保持细胞组织在活体状态下的成分和结构。1.FAA配方(1L)：福尔马林100ml，乙酸30ml，50%乙醇870ml；2.固定用的容器：青霉素小瓶，10ml离心管，蓝盖瓶等。Day2脱水切片材料脱水：除去组织内的水分，使细胞组织变硬，也便于透明剂进入细胞内。30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇，各1.5h。材料在70%乙醇中过夜或者4℃长期保存。Day3继续脱水、透明、透蜡1.70%乙醇中过夜的材料继续脱水;85%(1.5h)→95%(1.5h)→100%（1h）→100%（1h）为了使材料脱水彻底，纯乙醇要换2次，每次1h。2.透明：使透明剂二甲苯进入组织内，以便使石蜡透入组织。1/5二甲苯+4/5乙醇（1h）→2/5二甲苯+3/5乙醇（1h）→3/5二甲苯+2/5乙醇（1h）→4/5二甲苯+1/5乙醇（1h）→纯二甲苯（1h）→纯二甲苯（1h）。在装有材料的小瓶上画5格刻度线，每次吸取一格加入二甲苯，直至纯二甲苯。3.透蜡：透蜡注意从低浓度到高浓度，从低温到高温，使石蜡慢慢透入组织中，透蜡过程逐步升温37℃→42℃→58℃（可不用）。【将二甲苯吸出，仅剩没过材料的二甲苯，加入碎蜡至瓶满，碎蜡一完全融化，再加入碎蜡，直至瓶满。】透蜡持续三天。Day7纯蜡透蜡、包埋1.换用纯蜡继续透蜡，换纯蜡3次，每次2h，包埋。（此处在60℃--65℃恒温中进行，依蜡熔点而确定）。此时要换入液体状纯蜡，先将固体纯蜡在烧杯中80℃水浴或者用电炉烧开水使其熔化，然后放到60℃--65℃恒温箱中备用。2.包埋：使用包埋机进行,叠小盒子并作标记，将纸盒注入适量的蜡（依材料大小而定）。然后转至包埋机的冷冻台上，待小盒底部已有一层蜡固定时，加入材料并摆放好位置。Day8载玻片处理盖玻片、载玻片经洗洁精清洗或者10%盐酸泡过夜后，浸泡于95%乙醇中，晾干，将1mg/ml的多聚赖氨酸（PLL）稀释成终浓度0.1mg/ml（10ml母液加90ml的蒸馏水）；在染缸内用PLL（粘片）处理载玻片20—30min;取出晾干，装入盒内4℃保存。Day9：切片、展片、粘片切片前先修整蜡块，先将蜡块削成梯形，便于底部与蜡块相接，材料周围留1-2mm蜡。1．利用半自动轮转切片机制作切片，调整好蜡块定位器与切片定位器之间的距离，设置切片厚度（8—10μm）。2．旋转手柄，选取理想材料的切片迅速放入TK-218型恒温摊片烤片机的摊片水盘中，摊片机温度设置均为39-40℃。注意：由于温度较高且材料较大，切片易卷曲，摊片时易出现褶皱，摊片动作要迅速；切片蜡带有纵痕现象，很可能是刀上粘有小碎蜡，可取下刀片用二甲苯擦拭。切片前可将修好的蜡块放在冰上，有助于形成蜡带。切片卷曲是可调整刀片的角度。3待蜡片在水中完全展开后，用多聚赖氨酸处理过的载玻片从水中慢慢捞出蜡带，使其平展在玻片上，置于烘片栏上烘干（水滴烘干），37℃烘箱中烘片48h。（可根据材料调整烘片的时间）。Day12染色、封片染色目的：根据观察的部位及目的，使用相对应的染液，使植物组织染上颜色，以区分开来，便于观察。最常用的染液：苏木精（核，质染料）染色前将染液配好，苏木精需要一段时间的成熟过程，所以可以提前2-4周配好，用纱布包好瓶口，放在通风处。成熟后放在棕色瓶避光保存。使用时以原液一份（150-200ml）加入50%乙醇（150ml）与乙酸（150ml）混合。染液可回收利用多次。脱蜡→复水（各级乙醇，高→低）→染色→脱水→透明→封片封片：树胶封片，并盖上盖玻片，晾干，可长期保存。