Taq酶的活性测定方法

Taq酶的活性测定方法。（原理、方法、数据计算、结论）Taq酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。由于其自身的热稳定性，广泛应用于PCR反应中。酶活性测定常用的方法有终点法和动力学方法两类。终点法是测定完成一定量反应所需要时间，动力学方法是测定一定时间内所起的化学反应量。下面是介绍测定Taq酶活性的其中一种方法。Taq酶活性的测定方法：1、生物发光技术（1）原理：在DNA聚合酶催化DNA分子的聚合过程中伴随着焦磷酸（PPi）的生成，利用ATP硫酰化酶将焦磷酸定量转化成ATP，再利用虫荧光素酶系统发光检测ATP的量，从而确定PPi的量，以PCR反应体系中PPi的量来反映Taq酶的活性。（2）方法：ATP发光检测试剂盒的预处理:在商品化的ATP发光检测试剂盒中,为了增强发光的稳定性，加入了微量的焦磷酸，因此不能直接使用ATP发光试剂盒来检测焦磷酸。为了消除试剂中原有的焦磷酸，首先用低浓度的焦磷酸酶处理ATP发光检测试剂盒，每1000μL混合发光液中加入0.04U焦磷酸酶,混匀,室温下放置45~60min。焦磷酸的测定：在室温(25℃)条件下,取10μL含焦磷酸的样品于发光管中,然后分别加入80μLpH7.75的Tris缓冲液、10μL浓度为50μmol/L的APS及0.2UATP硫酰化酶,混匀,使样品中的焦磷酸转化为ATP。向发光管中加入100μL发光工作液,混匀,放入发光检测仪中,记录6s积分发光强度。分别取不同量的焦磷酸标准液,测定6s积分发光强度,绘制焦磷酸标准曲线。DNA聚合酶活性的表示方法：选择任一PCR扩增反应进行30个循环，分贝加入1U的不同种类（或者不同保存时间、不同批次）的Taq酶，反应完成后按（2）的方法检测PCR产物中焦磷酸的含量，根据焦磷酸的含量比较聚合酶的活性。（3）计算方法：酶活性比=焦磷酸量(使用不同保存时间的TaqDNA聚合酶)/焦磷酸量(使用已知活性的标准TaqDNA聚合酶)×100%（4）结论：该方法操作比较简便、灵敏度较高。测定Taq酶的活性获得较好的结果。2、荧光定量PCR检测Taq酶活性（1）原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。没经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增不同保存时间的Taq酶的活性聚合酶编号保存时间（月）保存温度（℃）焦磷酸（pmol)酶活性比（%）11421597.722420593.233420090.9412515168.6522510648.26标准品20220曲线图。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，在这个阶段可以进行定量分析。（2）方法：用不同浓度的质粒标准品建立实时荧光定量PCR标准曲线并检测该方法的灵敏性和重复性。在相同体系将Taq酶热启动后在不同的温度下进行定时测试其反应扩增量及其灵敏度。（3）结论：实时荧光定量PCR具有较好的线性范围、灵敏度、特异性及重复性。但是Taq酶活性的变化不仅影响荧光定量PCR系统的检测极限，而且影响荧光定量PCR系统测量的准确性。PCR的特异性也会随Taq酶活性的变化而降低。