25.病毒感染的检查方法与防治原则

1病毒感染的检查方法与防治原则南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系张其威PhDEmail：[e-mail]:3910035第25章2病原学诊断的意义•有助于临床治疗（抗生素、干扰素等）•为控制病毒学疾病的流行提供实验依据（疫苗等）3第一节病毒感染的检查4病毒感染的检查检测内容查病毒查特异性抗体病毒颗粒病毒抗原（如血凝素）病毒核酸（PCR）病毒酶类：如逆转录酶电镜直接观察光镜检查包涵体分离培养（如IgM、IgG）5一、标本的采集与送检原则基本与细菌相似，但应注意：1.标本用“双抗”（2000-10000U）或两性霉素B（2ug/ml)处理2.低温保存，尽快送检（冰块，CO2）3.血清学诊断采双份血清（发病初，2-3周）6二、病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离培养细胞培养（cellculture）鸡胚接种（egginoculation）动物接种（animalinoculation）7二、病毒的分离与鉴定一般程序：标本无菌处理动物接种鸡胚培养细胞培养指标阳性指标阴性病毒鉴定盲传2～3代指标阴性病毒阴性8（一）病毒的分离培养1.细胞培养（简述）单层细胞培养（monolayercellculture）分类悬浮细胞培养（suspendedcellculture）原代细胞（primarycell）细胞种类二倍体细胞（diploidcell）传代细胞系（continuouscellline）9病毒的细胞培养细胞培养瓶单层细胞101.细胞培养(1)原代和次代细胞培养组织组织块分散的单个细胞单层细胞剪碎培养基(原代细胞)单层细胞(次代细胞)传代培养蛋白酶11特点：①对多种病毒敏感②生长能力有限（20代）,获取成本高③可携带潜伏病毒（EB）1.细胞培养(1)原代和次代细胞培养12(2)二倍体细胞培养体外分裂50～100代仍保持二倍体染色体数目，可用于病毒分离和疫苗生产。特点：①对多种病毒敏感②不带异种蛋白(人源性)③不带病毒，无致瘤潜能④可传50-100代左右1.细胞培养13(3)传代细胞培养特点：①对多种病毒敏感性高②繁殖能力高，传代时间长③有致癌危险，不能用于疫苗生产（由肿瘤细胞或二倍体细胞突变而来）1.细胞培养142.鸡胚培养采用孵化9～14天的鸡胚绒毛尿囊膜（allantocherion）痘苗病毒、人类疱疹病毒尿囊腔（allantoiccavity）接种部位流感病毒、腮腺炎病毒羊膜腔（amnioticcavity）流感病毒的初次分离卵黄囊（yolksac）嗜神经病毒15尿囊腔162、鸡胚培养优点：易管理，不带微生物，成本较低缺点：操作程序复杂1718193.动物接种应用：尚无敏感细胞的病毒培养（HCV等）动物：兔、鼠、黑猩猩、猴等优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高，动物体内常带有潜伏病毒，安全性要求高201．病毒增殖鉴定(1)细胞病变效应（cytopathiceffect,CPE）①细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等（多数病毒）；②形成多核巨细胞或称融合细胞（麻疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒等）；③在培养细胞中形成包涵体（狂犬病病毒、麻疹病毒等）。（二）病毒的鉴定2122①细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落(1)细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)23麻疹病毒感染细胞呼吸道合胞病毒感染细胞②形成多核巨细胞或称融合细胞(1)细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)24③形成包涵体(inclusionbody)(1)细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)25腮腺炎病毒感染细胞(2)红细胞吸附（hemadsorption）病毒囊膜表面血凝素(HA)＋红细胞表面HA受体26(3)干扰现象（interference）风疹病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE(－)埃可病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE(＋)＋人胚肾细胞风疹病毒？埃可病毒（+）CPE(-)—风疹病毒(+)埃可病毒(-)CPE(+)—风疹病毒(-)埃可病毒(+)27(4)细胞代谢改变细胞代谢变慢pH改变（adenovirus）282.病毒形态学鉴定电子显微镜：设备、操作复杂，应用受限光学显微镜：可见大病毒（痘类病毒），对一般病毒检测意义不大293.病毒血清学鉴定鉴定病毒种、型、亚型(1)血凝抑制试验（hemagglutinationinhibitiontest）—正粘病毒型与亚型鉴定病毒＋鸡红细胞＝凝集（血凝试验/血凝效价）病毒＋特异性抗体＋鸡红细胞＝不凝集（血凝抑制试验）3031(2)免疫标记法（FIA、EIA/ELISA、RIA）——多种病毒鉴定(3)凝胶免疫扩散试验(gelimmuno-diffusiontest)——多种病毒鉴定3.病毒血清学鉴定324.病毒分子生物学鉴定抗原变异病毒基因的鉴定核酸扩增核酸杂交基因芯片基因测序33（三）病毒数量与感染性测定1.血凝试验：病毒总量（活病毒＋死病毒）2.蚀斑形成试验（plaqueformationtest）3.50％组织细胞感染量（50％tissuecultureinfectiousdose,TCID50）感染性病毒量(PFU)3435•CalculateTCID50.Formula:•TCID50/100ul=[(%positivevalue50%)−50%]/[(%positivevalue50%)−(%positivevalue50%)]*logDilutionfactor#+(logdilution50%)•#：10-folddilution,itis1.36(四)新病毒的鉴定核酸类型的测定(PCR)理化性状的检测（如对干、热、酸、脂溶剂的敏感性等）形态学鉴定（电镜）血清学鉴定（中和试验）基因测序和生物对比（序列同源性分析）37三、病毒感染的血清学诊断应用于：①采取标本分离病毒为时已晚②目前尚无分离此病毒的方法或难以分离的病毒③为证实所分离的病毒的临床意义④进行血清流行病学调查等381.中和试验（neutralizingtest）病毒＋中和抗体病毒失去感染性特点：特异性高，抗体维持时间长应用：人群免疫情况的调查临床诊断少用392.补体结合试验（complementfixationtest）用已知病毒可溶性补体抗原检测病人血清中相应的补体抗体特点：特异性低，抗体出现早，消失快应用：近期感染指标。40四、病毒感染的快速诊断数小时内出结果病毒颗粒病毒成分（抗原或核酸）早期抗体检测（IgM）41（一）形态学检查电镜和免疫电镜检查普通光学显微镜检查（包涵体）42（二）病毒成分检测1.病毒蛋白抗原检测免疫标记技术2.病毒核酸检测核酸扩增技术核酸杂交技术基因芯片技术基因测序43病毒引物444546（三）早期抗体检测可诊断急性感染特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒EA早期抗原抗体（急性感染晚期方可检出）EB病毒VCA衣壳抗原抗体（IgG急性感染期较早出现，终身可保持高水平；IgM仅于急性感染期出现）EBNA核心抗原抗体（IgM并非所有病人都有）47第二节病毒感染的特异性预防微生物及其代谢产物生物制品动物免疫血清（biologicalproducts）免疫细胞细胞因子防治和诊断感染性疾病48灭活疫苗（inactivatedvaccine）活疫苗（livingvaccine）重组载体疫苗（recombinantcarriervaccine）亚单位疫苗（subunitvaccine）化学提取或人工合成疫苗重组疫苗（recombinantvaccine）核酸疫苗（nucleicacidvaccine）一、人工主动免疫常用生物制品49二、人工被动免疫常用生物制品免疫球蛋白血清丙种球蛋白（紧急预防）细胞免疫制剂（病毒、肿瘤的治疗）IFN-α、β、γ细胞因子IL-2、IL-6、IL-12TNF、CSF淋巴因子激活的杀伤细胞——LAK细胞50第三节病毒感染的治疗核苷类药物非核苷类反转录酶抑制剂蛋白酶抑制剂其他抗病毒药物干扰素和干扰素诱生剂中草药基因治疗剂治疗性疫苗抗病化学制剂反义寡核苷酸干扰RNA核酶（ribozyme）51核苷类药物作用机制之一HSV/VZV无环鸟苷（NA）病毒胸苷激酶NA一磷酸宿主细胞激酶NA三磷酸（缺乏糖环3’-OH基）病毒DNA聚合酶抑制DNA复制：核酸链延伸被迫终止较高亲和力52干扰RNA•2006诺贝尔医学生理学奖瑞典卡罗林斯卡医学院２日宣布，将２００６年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了ＲＮＡ（核糖核酸）干扰机制。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息提供了基础性的依据。公报指出，ＲＮＡ干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。ＲＮＡ干扰机制的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒ＲＮＡ进行控制。诺贝尔奖评审委员会指出，ＲＮＡ干扰机制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。53TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006fortheirdiscoveryofRNAinterference-genesilencingbydouble-strandedRNA54思考题1.分离病毒的标本和做血清学诊断的标本各有何要求？2.常用组织培养法有几种？各有何应用？3.病毒在组织细胞中增殖的指标是什么？4.病毒性感染的快速诊断方法有哪些？5.预防病毒性感染有哪些人工自动免疫制剂？6.诊断病毒的核酸技术有哪些？