PCR-技术在食品检测中的应用

许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文PCR技术在食品检测中的应用PCR技术在食品检测中的应用许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000摘要传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别，该方法操作繁琐，有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌，使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点，所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCR技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点，包括：多重PCR技术、实时荧光定量PCR检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望，为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。关键词：食品检测；微生物培养；聚合酶链式反应；食品安全问题前言食品[1]是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物，而且它能最直接的与人体接触，进入人体的消化系统，所以食品安全问题[2-4]不容轻视。现代食品行业，在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物，这将严重危害食品的品质和人们的健康，甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术[5]是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是聚合酶链反应(PCR)成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食品的检测，具有广阔的发展前景。1PCR技术的原理PCR是在体外人为控制的合适条件下，以单链DNA或RNA为模板，以1对人工合成的寡核苷酸序列为引物，在耐热TapDNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特异性的引物外，还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液（dNTP）、TapDNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸3个基础步骤。反应时，首先将靶DNA双链加热变性为单链状态，然后降低溶液温度，加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对，形成部分双链。然后，在TapDNA聚合酶和4种dNTP底物存在的情况下，引物沿模板DNA链(靶DNA单链)按5‘末端向3‘末端方向延伸，自动合成新的DNA双链,新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期，每个周期约2-4min。按照这样的原理，目的基因将会以指数增加，通常的经过25～35次PCR循环，即可将靶DNA序列扩增近百万倍，实现目的基因迅速扩增。2PCR技术在食品检测中的应用食品检测的任务是运用生物、物理、化学等学科的科学技术及各种基本理论，对食品工业生产中的物料包括食品成品、副产品、半成品、原料、辅助材料等的状态和微生物状况及主要成分含量进行分析检测。多重PCR可以在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、无芽孢厌氧菌、战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检[6.7]；实时荧光定量PCR技术可用于食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等致病菌的检测[8-12]；张体银等[13]运用免疫PCR技术检测食品中的沙门氏菌，不仅灵敏性较高，而且没有假阳性和假阴性的出现，更加符合食品中病原微生物的快速检测要求。由于检测的目的不同，在食品检测过程中，检测对象的状态和性质的不同，所选择的检测方法也有差异。传统的食品检测方法有微生物分析法、仪器分析法、感官检验法、酶分析法和化学分析法。国际上在这方面的研究开发工作日新月异,其他学科的先进技术不断应用到食品检测领域中来。在此，主要介绍演化而来的不同的PCR检测技术。2.1多重PCR检测技术与常规PCR技术不同，多重PCR检测技术是在同一PCR反应体系里加入两对以上的引物，这样同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，可以同时检出多种病原微生物或对有多个型别的目的基因进行分型。通常采用的多重PCR技术通过对不同大小的目的条带进行扩增检测，目的条带大小必须区分开，才能够通过琼脂糖凝胶来检测，这就要求目的条带的扩增效率在不同引物竞争存在的条件下必须相差很小。并且目的条带也不能够太长，否则不同引物之间的PCR反应条件很难统一，一般最大片断不超过500bp，最长也不超过800bp。传统的多重PCR需要很多高浓度的引物在一个PCR反应管中进行反应，常常出现竞争抑制现象，从而导致多重反应的失败。通用引物多重PCR检测技术则只使用一条引物来扩增几个不同大小的PCR片段，而设计的特异性扩增引物的浓度仅需要使用相当于原浓度的百分之一或者千分之一，该方法克服了传统多重PCR的缺点。目前正在被应用于微生物致病菌、转基因产品以及肉类品种的鉴定上。高效性，系统性，经济简便性2.2实时荧光定量PCR检测技术实时荧光定量PCR检测技术是在反应体系中加入荧光标记因子，随着DNA的复制扩增，荧光信号不断增强，当仪器检测到荧光信号强度达到设定的荧光阈值时，记录下此时的循环数(即CT值)，同时仪器自动绘制出扩增曲线和熔解曲线。利用一系列的数学方法对得到的数据信息进行处理分析，达到实时定量检测DNA片段的目的。故采用实时定量PCR技术对目的条带的检测具有极高的灵敏度和特异性,并且能够进行准确定量。根据实时荧光定量PCR所用的荧光模式不同，实时荧光定量PCR方法分为荧光染料法和荧光探针法两种。2.2.1荧光染料法荧光染料法是在PCR体系中加入荧光染料，荧光染料能非特异性的结合到DNA双链的小沟中，通过荧光信号的积累监测反应进行，从而对目的基因进行定量[14]。常用的荧光染料有：SYBRGreen1、LCGreenTM1和PicoGreen，其中SYBRGreen1应用最为广泛，但PicoGreen比SYBRGreen1的灵敏度较高，具有RNA、ssDNA以及其他物质影响小和线性范围广等优点。荧光染料法的主要优势在于成本低，检测方法简单快捷，通用性好，不需要设计探针，能够高通量的定量PCR检测。但它不能识别特定的DNA模板，很容易受到引物二聚体和非特异性扩增产物的影响，所以想要得到好的定量结果，对PCR引物的特异性和PCR反应的条件要求较高。2.2.2荧光探针法荧光探针法是利用能与目的DNA片段特异性杂交的探针，对PCR扩增产物进行定量指示，由于其特异性高，主要用于专一序列的DNA检测[15-16]。其优点是高适应性和可靠性，重复试验结果高度稳定，但当目的基因序列较短时，实验效果不好。根据荧光基团标记和共振能量转移的方式，主要分为水解探针和杂交探针。典型的水解探针有TamanTM探针和TamanMGB探针。杂交探针有双杂交探针、分子信标和荧光标记引物/探针等。其中双杂交探针是以荧光能量共振转移技术为基础，其检测的不是累积信号，而是实时信号[17]；分子信标法是利用一种发卡结构式的单链DNA作为探针，在自由状态下3‘端的荧光报告基团和5‘端的淬灭基团相互靠近，荧光被淬灭。其特点是敏感度高，能够循环使用，可识别出单核苷酸差异的序列，对检测点突变有很好的效果。2.3免疫PCR检测技术免疫PCR技术是一种在免疫学和PCR技术基础上建立起来的新型检测技术[18]。在免疫PCR技术反应体系中，首先将已知抗体植入微板中以制备捕捉抗原的包被微板，然后再将抗原和检测抗体结合，最后利用桥联系统将异源DNA与整个抗原抗体体系连接，继而把DNA进行PCR扩增，从而定量分析得到检测结果。但免疫PCR的敏感性和特异性使其很容易受到环境以及操作的影响，所以经常会出现重复性差和不易标准化的问题。因此，控制交叉污染是检测中的一个重要环节。3展望食品在生产、运输、销售、储藏过程中受到微生物的污染是在所难免的，所以食品检测在针对微生物是十分重要的一方面。目前，传统的检测方法存在操作繁琐、准确度低、耗时长等弊端，不能达到快速精确监测食品的目的。利用PCR技术原理，人们尝试新的食品微生物检验方法，PCR检测技术凭借它的敏感、特异、简便、快速等特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步用于食源性病原菌的检测，并且取得了较好的效果。综上所述，PCR技术在食品质量控制领域是一种非常好现代化的工具，不仅为食品安全作出新的保障，还会为食品安全检测方面塑成新的检测标准。参考文献[1]侯国泉.全谷物食品定义与标准法规[J].农业机械.2011,01,18.[2]王凤平.我国食品安全问题研究[J].食品工业科技,2005,10,25.[3]陈君石.正确认识和应对食品安全问题[N].南方日报,2007,11,15.[4]郝记明,丽艳,李景明,等.食品安全及其控制食品安全的措施[J].食品与发酵工业,2004,02,29.[5]赵杰文,孙永海.现代食品检测技术[M].中国轻工业出版社,2015.[6]邓紫筠.多重PCR检测技术在食品微生物检测中的应用[J].生物技术世界,2013:69-70.[7]刘秀梅.食源性微生物危险性评估[J].中华流行病学杂志,2003,24(8):665-669．[8]杜雄伟,李叶,江洁,等.肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立［J］．食品工业科技,2013,34(12):68-70.[9]徐振波,刘晓晨,李琳,等.金黄色葡萄球菌肠毒素在食源性微生物中的研究进展［J］．现代食品科技,2013,29(9):2317-2324.[10]PillaR,SnelGGM,MalvisiM,etal.Duplexreal-timePCRassayforrapididentificationofStaphylococcusaureusisolatesfromdairycowmilk［J］．JournalofDairyResearch,2013,80(2):223-226.[11]吕艳芳,马春颖,励建荣.实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用［J］.食品与发酵科技,2014,50(2):80-84.[12]GubalaAJ.Multiplexreal-timePCRdetectionofVibriocholera［J］．JournalofMicrobiologicalMethods,2006,65(2):278-293.[13]张体银,黄晓蓉,郑晶,等．免疫捕捉－通用引物PCR检测食品中沙门氏菌［J］．食品科学,2009,30(12):233-23.[14]陈旭,齐凤坤,康立功,等.实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用［J］．东北农业大学学报,2010(8):148-155.[15]程海星,郭月英,任霆,等.实时荧光定量PCR技术原理及在食品检测中的应用［J］.食品与发酵工业,2015,41(3):243-246.[16]李彦霞,李智涛,王云,等.实时荧光定量PCR在食品检测领域中应用［J］.粮食与油脂,2010,(2):38-40.[17]钟江华,张光萍,柳小英.实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用［J］．氨基酸和生物资源,2011,33(2):68-72.[18]黄明,肖笑,徐晟,等．免疫PCR检测技术及其在食品安全领域中的应用［J］.南京农业大学学报,2010,33(6):119－124.