分子标记辅助育种

分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172781分子标记辅助选择育种主讲人：洪德林教授南京农业大学农学院2014年8月25日·南京025-84396626，[e-mail]分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172782内容：一、分子标记辅助选择的含义和意义二、分子标记的类型三、重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术四、作物MAS育种分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172783一、分子标记辅助选择的含义和意义选择是指从一个育种群体中挑出符合要求的目标基因型。传统育种是通过目标性状的表现型对基因型进行间接选择。分子标记辅助选择（Marker-assistedselection,MAS)是利用与目标性状基因紧密连锁的标记对基因型进行间接选择。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172784传统育种主要依赖对植株的表现型选择（phenotypicselection）。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172785例如抗病性的鉴定就受发病条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作就更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172786育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172787以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外源基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172788生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异，已在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/172789以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析、品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecularmarker-assistedselection,MAS)育种更受到人们的重视。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727810与传统的表现型选择相比，MAS的优点：1、不受等位基因间显隐性关系、其他基因效应和环境因素的影响，选择结果可靠。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278112、可在植株生长发育前期和育种早代时期进行选择，提高选择效率和缩短育种年限。(意义：省钱省时）分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727812（一）分子标记辅助选择的基本原理首先，通过基因定位或QTL分析，获得与目标性状基因或QTL连锁的分子标记。（什么是遗传标记？）分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727813200bp300bp100bp110bp120bp图1引物RM5629对5个杂交组合F1及其亲本的扩增带型1=863A；2=863B；3=86优8；4=宁恢8号,5=9522A；6=9522B；7=常优1号；8=R254；9=六千辛A；10=六千辛B；11=六优一号；12=77302-1；13=泗稻8号A；14=泗稻8号B；15=泗优422；16=LH422；17=03A；18=03B；19=3优18；20=C418.M：梯度为100bp的DNA大小标记分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727814200bp195bp180bp100bp300bp100bp200bp100bp300bp200bp100bp200bp300bp图1用SSR引物JESPR-110，扩增棉花P1、P2、F1及158个BC1F1单株总DNA的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图注：M为100bpladder的Marker，P1为T586，P2为T582。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727815分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727816办法是：通过构建包含目标性状分离群体（F2群体、BC1F1群体、DH群体或RIL群体、BIL群体）和连锁分析，获得与目标性状基因连锁的共显性分子标记。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727817基于PCR技术的分子标记，如SSR标记、SCAR标记、CAPS标记、STS标记等，是较理想的适用于辅助选择的分子标记。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278182.分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727819（分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278202.分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278212.分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278222.分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278232.分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727824然后，利用分子标记对目标基因型进行辅助选择。这是通过对分子标记基因型的检测间接选择目标基因型。分子标记与目标基因的连锁越紧密，选择效率越高。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727825有研究表明，若要选择效率达90%以上，则标记与目标基因间的重组率必须小于0.05。同时用两侧相邻的两个标记对对目标基因进行选择,可大大提高选择的准确性。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727826在回交育种程序中，除了对目标基因进行正向选择（前景选择）外，还可同时对轮回亲本的遗传背景进行选择（背景选择）。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727827分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727828（二）不同目标性状类型的分子标记辅助选择效率对于质量性状：在多数情况下，没有必要借助分子标记辅助。但在以下几种情况下，利用标记辅助选择可提高选择效率。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727829①表现型测定在技术上难度较大或费用很高，如抗病虫性。举例：玉米矮缩病，病毒不能通过卵子传递，抗病鉴定难度大。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727830分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727831分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727832②表现型只在个体发育后期才能测量。如籽粒蛋白含量。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727833③目标性状由隐性基因控制，在杂合世代不表现。④回交转育过程中，还需同时对背景进行选择。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727834对于多基因控制的数量性状：对多基因选择不但技术上更复杂，成本更高，而且由于每个QTL的贡献率较小，效率也更低。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727835尽管如此，一旦建立起QTL与分子标记的连锁关系，就有希望利用MAS进行改良。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727836借助分子标记对QTL进行辅助选择的成败主要取决于对QTL的精确定位以及QTL受环境因素和其他基因型影响的大小。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727837目前对QTL的分析在相当大的程度上还是建立在样本较小、实验精确性较低、统计分析未考虑上位性效应的基础上，仍需完善方法及其应用软件，从而更精确地估计QTL对表现型的贡献率。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727838二、分子标记的类型分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727839按技术特性，分子标记可分为四大类。第一类是以DNA分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记（restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP标记）。（第一代，20世纪70年代发现，1980用于构建人类连锁图）。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/17278401．RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶（restrictionenzymes，RE）酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727841对每一个DNA/RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727842某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离。然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727843用放射性同位素（如P32）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交（即Southern杂交）。若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727844放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况（图17-2）。分子标记辅助选择育种----作物商业化育种体系与育种技术培训班2020/5/1727845A1A2提取基因组DNA限制性内切酶样品A1A2A1A2Southern转印NC膜重物玻璃板吸水纸起胶滤纸20×SSC用打碎的鲑精DNA预杂交杂交放射自显影所揭示的RFLPMA1A2琼脂糖凝胶5'-ACGTGAT…TTACG-3'3'-TGCACTA…AATGC-5'DNA探针3'-TGC*ACTA…AATGC*-5'5'-ACGTGAT…TTACG-3'3'-TGC*ACTA…AATGC*-5'5'-AC*GTGAT…T