液相方法

©2007WatersCorporation液相色谱教程液相色谱教程液相色谱方法开发液相色谱方法开发©2007WatersCorporation2开发液相色谱方法开发液相色谱方法ƒ液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以下各项内容:—流动相:种类及配比(等度或梯度)—固定相:色谱柱类型及内径,长短—流动相输送系统参数:流速—检测器参数:检测波长,灵敏度等—温度控制—进样量ƒ以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称色谱条件©2007WatersCorporation3评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准ƒ问题∶什么样的分离结果是好的?分离度?©2007WatersCorporation4什么是液相色谱的分离度？什么是液相色谱的分离度？分离度的定义：)w(wvv122112+−=RR:分离程度的量度©2007WatersCorporation5影响分离度的因素影响分离度的因素kk′′,,αα,N,Nƒ分离度方程∶–k′是保留因子,表达了被分离组分与柱填料的作用强弱–α是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度,是化学因素–N是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛⎟⎠⎞⎜⎝⎛−⎟⎠⎞⎜⎝⎛+=411''NkkRαα©2007WatersCorporation6保留因子保留因子kk′′ƒ改变k'值的方法∶–调节流动相的极性、pH、离子强度等–梯度淋洗ƒ与峰高的关系ƒ与R的关系©2007WatersCorporation7分离因子分离因子ααƒ定义∶–α=1时两组分分不开ƒ改变α的途径–改变固定相–改变流动相–改变温度–改变样品的本身性质120102''kkttttRR=−−=ααα1−∝R©2007WatersCorporation8色谱柱的柱效色谱柱的柱效NNƒ理论塔板数计算公式：ƒWσ方法–Wtan16切线法–Wh5.54半峰高–W3σ93σ–W4σ164σ–W5σ255σ21⎟⎠⎞⎜⎝⎛=WVNσ©2007WatersCorporation9αα，，kk''，，NN::如何控制分离度如何控制分离度??©2007WatersCorporation10开发方法的其它考虑因素开发方法的其它考虑因素ƒ分离度是色谱分离中主要考虑的因素ƒ除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考虑:–灵敏度–载样量–分析速度–溶剂损耗–成本–容易使用–色谱柱寿命–效率©2007WatersCorporation11方法开发方法开发::第一步干什么第一步干什么??ƒ想办法得到各种信息–向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法–查文献，如CA(化学文摘)–仪器制造商的文献，如Watersƒ对色谱柱有足够的了解–掌握分离机理，自己开发方法ƒ充分了解自己的样品©2007WatersCorporation12参照文献方法时的注意事项参照文献方法时的注意事项ƒ采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…),否则不能重现文献结果ƒ注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重现文献的梯度方法ƒ注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和浓度…)ƒ注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新,尽可能采用HPLC新技术©2007WatersCorporation13一般的具体步骤一般的具体步骤ƒ先用一根短的色谱柱ƒ用相对较高的流速ƒ使用尽可能高纯度的标准品ƒ先用高强度的洗脱液ƒ调节k′值改变保留值ƒ调节α值改变选择性ƒ调节柱长度改变柱效及分离速度请记住∶每次改变一个参数©2007WatersCorporation14反相色谱方法开发实例反相色谱方法开发实例ƒ色谱条件∶–色谱柱：C18，4mm×30mm–流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱–流速：2ml/minƒ样品：–①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)–②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)–③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)©2007WatersCorporation15实例实例1:1:改变保留因子改变保留因子kk''60/4050/5040/60①②③①②②③③①ƒ实例1谱图©2007WatersCorporation16ƒ通过改变流动相改变选择性–同样强度的不同溶剂ƒ改变色谱柱的影响会更大实例实例2:2:改变选择性改变选择性((αα))①②③62:38/42:58/72:28/2322，③，②，①OHCNCHOHMeOHOHTHF©2007WatersCorporation17离子抑制色谱离子抑制色谱ƒ离子型化合物在反相色谱柱上不保留ƒ改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离ƒ适用于弱酸性化合物的分离–降低流动相的pH值，使样品降低离子化–使用硅胶基质C18填料ƒ使用条件应在填料基质的安全范围内–硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间H++Ac-HAcƒ在稀溶液中:©2007WatersCorporation18离子抑制色谱实例离子抑制色谱实例ƒ在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234©2007WatersCorporation19常用缓冲液及其常用缓冲液及其pHpH值值名称pKaPhosphoricAcid磷酸2.12(pKa1)FormicAcid甲酸3.75SuccinicAcid琥珀酸4.19(pKa1)AceticAcid乙酸4.75SuccinicAcid琥珀酸5.57(pKa2)PhosphoricAcid磷酸7.21(pKa2)BoricAcid硼酸9.24PhosphoricAcid磷酸12.32(pKa3)©2007WatersCorporation20离子对色谱法离子对色谱法ƒ在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂–与样品中可电离的组份形成“对离子”–目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物ƒ离子对试剂的类型–PICA：磷酸季丁铵，适用于酸性组份–PICB：烷基磺酸盐，适用于碱性组份o烷基长度不同，形成对离子的能力不同o通常有：B5，B6，B7，B8–PICD4：磷酸二丁胺，适用于弱碱©2007WatersCorporation21离子对色谱机理离子对色谱机理OO(C~C)nSO3-Na+加(C~C)nSO3-N+C4C4C4C4N+C4C4C4C4OH-流动相加0.01M的SiOSiC18OOPIC-A试剂©2007WatersCorporation22离子对色谱分析水溶性维生素离子对色谱分析水溶性维生素NCONH2NH3CHOCH2OHCH2OHNNNNH3CH3COOCH2CHCHCHHOHOHOCH2OHNNH3CNH2CH2NSCH2CH2OHCH3{}Cl-+1.Niacinamide烟酰胺2.Pyridoxine吡哆素，VB63.Riboflavin核黄素，VB24.Thiamine硫胺素，VB1©2007WatersCorporation23用不同的离子对试剂用不同的离子对试剂色谱柱∶μBondaPakC183.9mm×300mm溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC-B72.MeOH/H2O,PIC-B53.MeOH/H2O,PIC-B7/B5②①③④1.如用PIC-B7，在②③分开的情况下，保留时间太长②①③④2.如用PIC-B5，峰①②④分不开②①③④3.如用PIC-B7加B5，各组份分开，且保留时间合适©2007WatersCorporation24离子对色谱离子对色谱--水溶性维生素水溶性维生素保留时间与PIC试剂B之间的关系保留体积ml36ml4ml烟酰胺吡哆素(VB6)核黄素(VB2)硫胺(VB1)B5B750%(B5/B7)©2007WatersCorporation25离子对色谱离子对色谱的优缺点的优缺点ƒ优点:–可用反相色谱分析离子–离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成–通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中性和离子型溶质ƒ缺点:–PIC试剂的平衡较慢o推荐专用色谱柱作离子对分析–当心PIC试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀–当心用过的离子对试剂的化学污染©2007WatersCorporation26用离子对？还是离子抑制？用离子对？还是离子抑制？中性物质PICA酸性物质PICB碱性物质RSO3HRCOHOROSOHOOROPOHOORNH2R2NHR3N(R4N+)-CH3OH/0.01M(NH4)2HPO4CH3CN/H2OCH3OH/H2O磺酸染料苯甲酸马来酸雌酮磷酸地塞米松氢化可的松对苯二甲酸二乙脂，苊多巴胺VB2，肾上腺素可待因洁尔灭离子抑制CH3OH/1%HAcCH3CN/NaH2PO4氢化可的松对苯二甲酸二乙酯，苊©2007WatersCorporation27什么是梯度方法什么是梯度方法90/10,CH3CN/H2O80/20,CH3CN/H2Oƒ梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化©2007WatersCorporation28梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点ƒ优点–单位时间的分离能力增加–检测灵敏度提高ƒ缺点–仪器设备要求高–不适合某些检测方式–色谱柱需再生–定量分析的重复性较低©2007WatersCorporation29梯度洗脱的方式梯度洗脱的方式ƒ高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）泵©2007WatersCorporation30梯度滞后梯度滞后::系统体积的影响系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度阻尼器混合器©2007WatersCorporation31滞后体积大小的影响滞后体积大小的影响ƒ滞后体积太大会引起梯度变化的延迟–例如∶滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/mino实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题–对微柱色谱影响更大，如上例，流速0.1ml/mino实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受ƒ滞后体积的不同会使方法转换麻烦–滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现ƒ普通HPLC的滞后体积为2~4ml–对分析型HPLC没有影响–对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小的液相色谱仪，以适应梯度实验©2007WatersCorporation32梯度洗脱的可变参数梯度洗脱的可变参数ƒA,B液的化学特性和配比ƒ梯度的起终点及陡度ƒ梯度变化的路径(梯度曲线形状)1243567891011©2007WatersCorporation33梯度曲线的变化∶凹线梯度曲线的变化∶凹线Curve630-100%Curve730-100%Curve830-100%©2007WatersCorporation34梯度曲线的变化∶凸线梯度曲线的变化∶凸线Curve630-100%Curve530-100%Curve430-100%©2007WatersCorporation35梯度平衡时间的影响梯度平衡时间的影响ƒ10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复©2007WatersCorporation36梯度平衡时间的影响梯度平衡时间的影响平衡时间∶6分钟平衡时间∶7分钟平衡时间∶8分钟平衡时间∶9分钟ƒ平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足©2007WatersCorporation37水中有机污染物的影响水中有机污染物的影响214nm0.1AUFS254nm0.1AUFSƒ50ml超纯水的有机物污染状态©2007WatersCorporation38水中有机污染物的影响水中有机污染物的影响214nm0.1AUFS254nm0.1AUFSƒ典型的“实验室水”有大量