转基因技术与生物安全--作业

转基因技术与生物安全学院：农学院专业：农学姓名：郭亮学号：20114011215小麦转基因研究进展近10多年，基因转移技术有了新的发展，DNA可直接转移于可再生胚性愈伤组织，为外源基因转移增加了新途径。这些离体技术的发展与应用，成为常规作物改良的有益补充。小麦转基因研究领域包括染色体介导的基因转移和直接的基因转移。前者属于染色体工程范畴，研究起步较早，已成功应用于普通小麦和杜轮小麦的遗传改良。然而通过有性杂交进行种质改良的染色体工程技术有其局限性，例如导致了非期望染色质的转移，并且其后的负向遗传互作可能导致不育。后来发展起来的直接基因转移技术，能将应用其他技术很难导入的新基因引入小麦，并使之整合于小麦基因组中。一般狭义的转基因指直接的基因转移。直接基因转移是将从非相关生物中分离的已知基因插入受体细胞，并使之再生为可育植株。该项技术可以无限地利用基因资源，打破有性杂交的局限性。但小麦是进行遗传转化最晚的主要作物，培育转基因小麦进展缓慢的主要原因，首先是缺乏有效的离体再生体系，其次是一般认为禾谷类作物不在根癌农杆菌寄主范围之内。转基因小麦培育成功最早的实例是通过高效再生系统与基因枪介导的基因转移相结合取得的。近年利用根癌农杆菌介导法获得转基因小麦的实践表明，该种方法可能有助于克服基因枪介导的转基因植株的负面效应。1.遗传转化的前提1.1小麦的离体再生有效的再生体系是获得转基因植物的前提。小麦叶片、顶端分生组织、根、幼穗和成熟胚及幼胚都曾被用作外植体进行小麦植株再生，并获得了成功。研究表明，离体再生可通过器官发生或体细胞胚再生来实现。后者可以在较短的时间内形成小苗，因而体细胞胚发生优于器官发生。Nehru等研究出另一种途径，即从未成熟胚中除去胚轴培养分离的盾片，除去胚轴有助于盾片细胞中成胚愈伤组织的形成。这个过程表明大多数有竞争力的成胚细胞存在于盾片中，使成胚愈伤组织更为丰富，加速了体细胞胚的形成。高度再生性的面包小麦品种Fielder，一个盾片可形成15个以上的体细胞胚，5周之后可形成小苗。相比来说，用整个幼胚培养则需要几个月的时间形成小苗。而且分离的盾片培养很大程度上不依赖于基因型，但不同的品种具有不同的效率。Maes等发现普通小麦和杜轮小麦影响盾片培养的离体再生因素存在差异。Bommineni和Jarreau提出了4个商品杜轮小麦品种利用分离盾片快速离体再生的标准化规程。利用最适宜的诱导和再生培养基，这些品种每个盾片平均可形成16棵小植株。因此在组织培养再生小麦植株中，分离盾片培养成了最为有效的再生体系。小麦的遗传转化中大多倾向于以盾片作外植体。现在未成熟胚也可通过根癌农杆菌介导转化培育转基因小麦。1.2基因表达载体转化细胞的选择对培养转基因植株、基因的调节表达及表现期望的转基因诱导的表现型尤为重要。基因在受体细胞中的表达是形成遗传转化的第一步。不需要整合，DNA导入后1~48h报道基因或标记基因的瞬时表达，已经广泛作为鉴定转化细胞的重要参数。一个理想的报道基因应编码一条具有结构简单、低分子量和抗蛋白酶的多肽，而且应具有较长的半衰期，还要在较广的pH和温度条件下保持稳定，具有酶活性，从而易于在非破坏性分析中测试。并非所有报道基因都符合上述条件。编码氯霉素乙酰转移酶（cat）和β-葡糖苷酸酶的报道基因已普遍用于小麦来建立转化参数。从水母中分离出的绿色荧光蛋白基因（GFP）也用于遗传转化中的标记基因。GFP已在植物中表达，其中包括小麦。为快速有效地选择出离体转化细胞，同时在最短的时间内培养成转基因植株，应采用高水平表达的选择标记基因。转化细胞的有效选择受选择性标记基因和其表达产物及用于选择转化体的化学药剂的密切互作的影响。新霉素磷酸转移酶基因具有对葡糖胺抗生素的抗性，普遍用作转基因植株的选择性标记基因。bar基因已成功用于培育转基因小麦。转移后的基因应以调节的方式并在适当的水平上表达，并表现出期望的表现型。连接于基因5`末端的DNA调节序列（启动子）控制转基因产物表达的时间和数量。组成型启动子可以使标记基因较高水平表达，在植物遗传转化中起重要作用，尤其是在禾谷类作物中。大量启动子已用于培育转基因小麦，其中常用的有花椰菜花叶病毒病35sRNA启动子，含有增强子的花椰菜花叶病毒启动子，水稻肌动蛋白启动子，玉米泛素蛋白启动子和合成的pEmu启动子。这些组成型启动子在培育转基因小麦的效率方面现仍未进行详尽的研究。随着转基因技术向着培育有益性状的方向发展，启动子的研究开发也将从组成型向组织特异型方向转移。2.转基因小麦的分子证据世界上已有多个实验室培育出转基因小麦。或者利用培育几天的未成熟胚或者利用未成熟胚的愈伤组织作外植体，用基因枪法插入基因。为培育转基因杜轮小麦，以含有gus（作为报道基因）和bar（作为选择标记基因）的基因表达载体，轰击从受粉后10~12天的颖果上分离的盾片。7天之后，将具有胚性愈伤组织的盾片转移于光照条件下，此后转移于再生培养基。形成的体细胞胚在含有L-PPT的培养基上培养，获得的绿色小苗移植于土壤至成熟。采集其幼叶进行生化和分子分析，可检测出活性GUS酶和PAT酶；组织化学分析表明，花粉、子房和籽粒中具有GUS活性；利用Southern印迹杂交证实了sus和bar基因已插入小麦基因组，并在后代中检测到转移的基因。3.转基因技术的应用转基因技术为利用丰富多样的基因库进行小麦改良开辟了新路。生物和非生物的胁迫是实现作物最大产量潜力的主要障碍。转基因技术在培育耐除草剂和抗病虫害作物方面已相当成功。非生物胁迫主要有干旱、高温和冻害，常常是多基因性状，目前还难以利用遗传转化技术进行改良。然而，随着非生物胁迫遗传调控研究的进展及有关基因的分离，可促进非生物性胁迫耐性转基因小麦的培育。通过改变面筋蛋白的品质和数量及修饰胚乳淀粉结构，转基因技术已成功地应用于小麦籽粒品质改良。3.1抗除草剂小麦的培育人们常用除草剂防除杂草，但除草剂的应用受作物生长阶段的严格限制。在杀死杂草的同时，除草剂往往对作物生长也有不利影响。大多数常用的广谱性除草剂的作用机理是通过抑制作物生长的必需氨基酸的合成而实现。通过插入可使除草剂失活的基因或产生抗此除草剂的目的酶的基因，可减轻除草剂对作物的危害。从Steptromyceshygroscopicus分离出的bar基因编码可使PPT醋酸基化的PAT酶，从而使其失活。同时bar基因也是转基因小麦培育中广泛应用的选择性标记基因。已培育出的抗草甘膦的六倍体小麦和杜轮小麦，或是通过改变目标位点使除草剂失活获得草甘膦抗性，或是通过编码草甘膦氧化还原酶（GOX）的基因表达（可降解草甘膦）获得草甘膦抗性。3.2小麦籽粒蛋白品质的改良淀粉和蛋白质是小麦籽粒的主要组成成分。小麦面粉品质取决于面筋的数量和质量。面筋使面团兼具粘性和延展性，是面包粉质量的主要决定因素。面筋是麦胶蛋白和麦谷蛋白两种醇溶蛋白形成的连续性的蛋白网络。麦谷蛋白的高分子量亚基（HMW-GS）在小麦面粉的烤制面包特性中尤其重要。较大数量的高分子量麦谷蛋白亚基形成了更具弹性的面筋多聚体，改良了面包品质。因而在小麦籽粒中增加高分子量麦谷蛋白亚基就成为遗传工程技术中改良籽粒品质的目标。Blechl和Anderson在天然HMW-GS启动子的调控之下，在小麦品种Bobwhite中获得了可表达的新的杂种麦谷蛋白亚基，这是关于小麦籽粒中种子贮藏蛋白基因工程的首例报道。其后，Altpeter等报道了小麦品种BobwhiteHMW-GS-1Axl基因的表达，也增加了籽粒中HMW蛋白质的含量。Barro等利用小麦近等基因系研究HMW-GS基因的差异性表达发现，插入基因的表达与小麦籽粒中HMW-GS的数量有关。第二代种子的分析表明，1个或2个额外的HMW-GS显示出面团延伸性的梯度性增加，从而表现出通过遗传工程改良小麦面粉特性的潜力。3.3小麦籽粒中淀粉结构的饰改小麦籽粒中大约2/3到3/4的成分由淀粉组成，可分为两类葡聚糖多聚体：线性的直链淀粉和高度分枝的支链淀粉。直链和支链淀粉的比率决定了淀粉的理化性质，也就决定了其最终用途。禾谷类作物淀粉的生物合成是通过几种酶的协同作用完成的，包括腺嘌呤葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分枝酶（SBE）和淀粉去枝酶。在玉米、大麦、水稻等作物上，上述任一淀粉生物合成基因通过自然突变失活，都可导致淀粉结构的改变。然而由于小麦是六倍体，具有3套染色体组，自然产生或人工诱导这类突变体的可能性微乎其微。利用遗传工程方法则可以调节小麦籽粒中淀粉生物合成酶活性从而改变淀粉结构。遗传工程曾用于调节小麦中SBE活性，SBE催化葡聚糖多聚体上形成α-1,6分枝，并与淀粉合成酶协同作用控制支链淀粉生成的数量。小麦基因组至少编码2种类型的SBE，即SBEI和SBEII，已经克隆出与之相应的cDNA。为修饰小麦淀粉结构，在多个小麦品种中导入了控制小麦Sbe1正向和反向cDNA表达的、携带单子叶启动子的表达载体。对经反义Sbe1基因转化的红硬粒春小麦的SBE活性进行分析，发现在开花后14天的籽粒中检测出了不同分枝酶活性，其中一个转基因小麦系表现出比非转基因小麦低10倍的分枝酶活性。籽粒发育中低分枝酶活性与成熟籽粒中较大数量的HMW相关。进行X-射线晶体衍射分析发现，经修饰的淀粉较正常淀粉结晶性差。差异性热力学扫描显示，转基因小麦淀粉在较低温度下成为明胶状，并且与从非转基因的小麦植株中提取的淀粉相比，具有显著低的热焓值。这些结果表明，遗传工程可用于改变小麦淀粉结构。3.4一种提高基因转化效率的方法———单倍体与转基因技术的结合花药和小孢子培养被有效地用于培育单倍的六倍体小麦。但这些技术不适于杜轮小麦。与玉米杂交成为培育普通小麦和杜轮小麦单倍体的有效方法之一，已广泛应用于小麦的遗传改良。来自单倍体的纯合系有助于缩短育种周期。小孢子来源的单倍体原生质体也为培育转基因植株提供了有益的材料。通过电融合法实现了基因向花粉原生质体的转移。花粉和小孢子培养形成的愈伤组织有利于微粒轰击法进行遗传转化。单倍体水平直接整合外源基因，其后进行染色体加倍有利于基因稳定地导入小麦。4.结语小麦直接转基因新技术取得了令人鼓舞的进展，现已成功进行了六倍体小麦和杜轮小麦品种的遗传转化。为在小麦改良中成功地应用转基因技术，需对影响基因在受体细胞中稳定性表达的有关因素重点加以研究。转基因技术可以将不同来源、定义明确的基因整合于小麦，改良农艺性状或加入新的性状。转基因技术也可用于降低生产者的投入，如插入硝酸转移酶基因，有可能提高氮肥的吸收效率；插入病虫害抗性基因，从而具有内在抗性。通过对HMW-GS和GS基因的研究，表明小麦可利用转基因技术生产高附加值产品；通过插入从其他生物中分离出的基因，可在小麦籽粒中生产各种各样的碳水化合物、蛋白质和其它有用的产品。