Waters液相分析方法开发

©2011WatersCorporation2内容内容内容内容
介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发
影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法
系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例
沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation3内容内容内容内容
介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发
影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法
系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例
沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation4方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性
质量研究方法开发工作贯穿于整个药物开发项目过程中—样品的复杂程度各异—工作繁复冗余
方法开发耗时耗力、成本不菲—加速流程才能尽早将产品带入市场—提速色谱方法将提高项目收益率©2011WatersCorporation5方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤©2011WatersCorporation6
根据分析物的化学性质选配色谱条件—基于既往经验及思考进行合理猜测—通常辅以资料参考—询问同事
“步进式”测试开发—基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
系统性筛选策略—先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试o评估结果，选择最有效的条件组合—再进行方法优化o梯度/温度色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路©2011WatersCorporation7色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相流动相流动相流动相pHααααSelectivity液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段αααα分离选择性分离选择性分离选择性分离选择性©2011WatersCorporation8内容内容内容内容
介绍—进行方法开发的途径—系统性方法开发
影响选择性的主要因素—固定相—有机溶剂—流动相pH值—流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法
系统性方法开发策略—雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例
沃特世HPLC色谱柱产品©2011WatersCorporation9影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素选择性最为重要选择性最为重要选择性最为重要选择性最为重要11+−kkαα4N=RsMaximizedinUPLCSeparationsby:
Rangeofcolumnchemistries
Multipleparticlesubstrates
WideusablepHrange[BEH]
Highretentivity[HSS]
Widerangeinselectivity[CSH]MaximizedinUPLCSeparationsby:
Ultra-lowdispersionsystem
Small[2µm]particles
Higherpressurecapability
Well-designedcolumnsPhysicalChemicalImpactonResolutionDoubleNDoublekDoubleαααα%Improvement20–40%15–20%400%©2011WatersCorporation10©2011WatersCorporation11直观图表显示直观图表显示直观图表显示直观图表显示pH7pH7pH7pH7选择性选择性选择性选择性（（（（RPRPRPRP））））(ln[k]acenaphthene)YMC-Pack™ODS-A™YMCJ'sphere™ODS–H80ACQUITYUPLC®BEHXBridge™C18Hydrophobicity062010SunFire™C18YMC-Pack™PolymerC18™Hypersil®CPSCyanoYMC-Pack™CNWatersSpherisorb®S5PACQUITYCSH™XSelectCSH™Fluoro-PhenylNova-Pak®PhenylYMC-Pack™PhenylHypersil®PhenylInertsil®Ph-3YMC-Pack™ProC4™YMCbasic™Symmetry®C8YMC-Pack™ProC8™Nova-Pak®C8XTerra®MSC18Symmetry®C18YMC-Pack™ProC18™Inertsil®ODS-3Nova-Pak®C18YMCJ'sphere™ODS–L80Nucleosil®C18WatersSpherisorb®ODS2WatersSpherisorb®ODS1Resolve®C18µBondapak™C18YMC-Pack™ODS–AQ™YMCJ'sphere™ODS–M80Inertsil®CN-3WatersSpherisorb®S5CNNova-Pak®CNHPSymmetryShield™RP8SymmetryShield™RP18XTerra®RP8XTerra®RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5(ln[α]amitriptyline/acenaphthene)XTerra®MSC8Luna®C18(2)XTerra®PhenylLuna™PhenylHexylChromolithTMRP-18Atlantis®dC18Zorbax®XDBC18ACTAce®C18Zorbax®SBC18SunFire™C8Luna®C8(2)ACQUITYUPLC®BEHXBridge™ShieldRP18ACQUITYUPLC®BEHXBridge™C8ACQUITYUPLC®BEHXBridge™PhenylAtlantis®T3ACQUITYUPLC®HSST3HSSHPLCT3ACQUITYUPLC®HSSC18HSSHPLCC18ACQUITYUPLC®HSSC18SBHSSHPLCC18SB沃特世提供10种不同反相UPLC/HPLC柱固定相，覆盖广泛范围下的选择性和疏水性SelectivityACQUITYCSH™XSelectCSH™C18ACQUITYCSH™XSelectCSH™Phenyl-HexylHypersil®BDSPhenylSilanolActivity©2011WatersCorporation12沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具©2011WatersCorporation13考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型
利用一组性质不同的参考化合物在不同色谱柱上进行实验,以找出不同实验因素(色谱柱、溶剂和pH)对分离选择性影响的一般规律—4.6x100mm,3.5µm色谱柱—AmmoniumFormate(甲酸铵缓冲液),pH3—AmmoniumBicarbonate(碳酸氢铵缓冲液),pH10—Methanol—Acetronitrile—使用10至90%溶剂的15分钟梯度—柱流速1.4mL/min—仪器为WatersAlliance®2695HPLC连接2996PDA和Micromass®Quattromicro™©2011WatersCorporation1412.Octanophenone(N)MW204.35.1-Pyrenesulfonicacid(A)MW304.3参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构::I.I.有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质10.Diclofenac(WA)MW318.1NHO-OClClNa+11.Dinoseb(A)MW240.2N+N+O-O-OOOHCH3CH31.GentisicAcid(A)MW154.1OOHOHOH8.Flavone(N)MW222.2OO©2011WatersCorporation15NCH3CH3NHOHOHOHCH33.Ritodrine(B)MW287.4NNCH3OCH3OHH4.Hydroquinidine(B)MW204.37.Amitriptyline(B)MW277.46.Imipramine(B)MW280.42.Caffeine(WB)MW194.2NNNNOOCH3CH3CH3NNCH3CH3ON9.4-Dimethylamino-benzophenone(WB)MW225.3参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构:II.碱性物质碱性物质碱性物质碱性物质©2011WatersCorporation16SunFire™C8SunFire™C182135476981110122,1354769,1081112分离选择性差异分离选择性差异分离选择性差异分离选择性差异SunFire™C8与与与与SunFire™C18相同基质颗粒上的C8和C18间分离选择性的差异微小.C8对某些化合物的保留比C18小些.1.GentisicAcid(A)2.Caffeine(WB)3.Ritodrine(B)4.Hydroquinidine(B)5.1-Pyrenesulfonicacid(A)6.Imipramine(B)7.Amitriptyline(B)8.Flavone(N)9.4-Dimethylaminobenzophenone(WB)10.Diclofenac(WA)11.Dinoseb(A)12.Octanophenone(N)低低低低pH,乙腈乙腈乙腈乙腈©2011WatersCorporation17相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异:XBridge™Phenyl与与与与C18和和和和ShieldRP18间的比较间的比较间的比较间的比较XBridge™ShieldRP18XBridge™C18XBridge™Phenyl我们可以观察到当固定相配基类型发生改变时，分离选择性有显著变化。苯基柱对三环类抗忧郁剂（峰6和7）的保留能力比在C18柱上还要强。Jenkins,Diehl低低低低pH,乙腈乙腈乙腈乙腈135672489,10111210986451171321213674,5821091112©2011WatersCorporation182,1354769,10811122354769,10811121不同基体不同基体不同基体不同基体C18柱间的分离选择性差异柱间的分离选择性差异柱间的分离选择性差异柱间的分离选择性差异:硅胶柱与杂化颗粒柱硅胶柱与杂化颗粒柱硅胶柱与杂化颗粒柱硅胶柱与杂化颗粒柱SunFire™C18XBridge™C18硅胶颗粒与杂化颗粒基体材料的不同亦会带来些许的分离选择性的差异pH3,乙腈乙腈乙腈乙腈©2011WatersCorporation19色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱流动相流动相流动相流动相pHααααSelectivity液相色谱分