5章-农药、兽药残留速测技术

第五章农药、兽药残留速测技术农药中毒事件回顾海南“毒豇豆”事件2010年1月，海南豇豆在武汉白沙洲农副产品市场连续三次被检测出含有禁用农药水胺硫磷。随后在武汉、上海、郑州、合肥、杭州、广州等11个城市检测出海南豇豆农药残留超标。仅武汉销毁毒豇豆3596.9公斤水胺硫磷，是一种高毒性农药，早在2002年，农业部已将它例如黑名单中，禁止在水果蔬菜、中草药植物上使用。它能经由食道、皮肤和呼吸道，引起人体中毒。农药中毒事件回顾青岛“毒韭菜”事件2010年4月，青岛一些医院陆续接到9名食用韭菜后中毒的患者，他们都是食用韭菜之后出现了头疼、恶心、腹泻等症状，经医院检查属于有机磷中毒，也就是说韭菜上的残余农药严重超标导致中毒。随后，检出农药残留超标韭菜1930公斤。农药中毒事件回顾张裕红酒农药超标事件2012年8月7日某媒体报道：记者将三家国内葡萄酒上市公司的十款葡萄酒送国家食品质量监督检验中心检测，均检出多菌灵或甲霜灵农药残留，而张裕产品残留值超过另两家。多菌灵为美国禁用的农药，有导致肝癌的风险。张裕A股价直奔跌停，最终大跌9.83%•2001年，杭州的空心菜有机磷中毒事件。•2003年，南京蔬菜有机磷残留导致中毒的事件。•2007年，福建大田发生有机磷污染水源导致中毒事件。•2008年1月，日本发生饺子中毒事件，该饺子被化验出含甲胺磷残留……•2008年1月9日，中国决定停止甲胺磷、对硫磷等五种高毒农药的生产、流通和使用。•2011年3月，河南毒韭菜事件—有机磷中毒(超标农药残留主要是甲拌磷)6一、前言随着人们环境意识的不断加强，由农药引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。为了保障消费者的安全和健康，提高农产品的质量安全水平，增强农业产品的国际竞争力，我国政府决定加强农产品中农药残留的监控，建立健全农药残留的检测体系，实施对蔬菜、瓜果、茶叶生产全过程的农药监控，从源头抓起，加强农产品的产地检测，把住农产品的市场准入关。7（一）农药概念农药(pesticides)是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草及其他有害生物，以及有目的地调节植物、昆虫生长的的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。现在农药不仅应用于农业，而且也广泛应用于畜牧业、林业和公共卫生事业等方面。一、概述8（二）农药残留的概念农药残留是指农药使用后残存于生物体、食品(农副产品)和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。农药残留几乎无处不在！！土壤水体空气农药植物动物人10（三）农药的分类1.按化学成分可分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类及砷、汞、铜、硫磺等制剂。2.按用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂和粮食熏蒸剂等。11（四）农药的毒性及种类农药除了可造成人体的急性中毒外，绝大多数对人体产生的慢性危害，多是通过污染食品的形式造成。某些农药对人和动物的遗传和生殖造成影响，产生畸形和引起癌症等方面的毒素作用。我国农药的发展20世纪80年代前，中国生产的农药尚不足80种，大多是进口，农药主要是有机氯。1983年禁止生产和使用有机氯农药后，代之以有机磷、氨基甲酸酯类农药，但其中一些品种比有机氯的毒性大10倍甚至100倍。90年代之后，中国逐渐由农药进口国变成出口国，近两年，农药进口量只相当于产量的2%-3%，出口量已是进口量的十几倍。131、有机氯农药•品种：DDT、六六六、艾氏剂、狄氏剂等。•特点：化学性质稳定，不易分解，易溶于脂肪中，并在脂肪中蓄积，长期使用会严重的环境污染。•危害：有机氯农药容易积累在人体的脂肪、肝脏、肾脏等部位，并且不容易排除体外。DDT：当人体蓄积的浓度20mg/kg时，神经系统放生障碍，达到500mg/Kg时，可以致死。动物实验证实有致畸、致癌作用•目前许多国家都已禁止使用，我国已于1983年全部禁止生产和使用。15HClClClClClCl六六六，BHCClClCHCCl3滴滴涕，DDT16滴滴涕：减少了蛋壳的厚度，从而降低了小鸟的孵出率。二恶英：进入机体后几乎不被排泄、沉积在肝脏和脂肪组织中。属于剧毒物质，毒性比氰化钾高130倍，致癌毒性比黄曲霉毒素高10倍，会引起基因突变，影响繁殖力和智力发育。17早期的高效高毒品种：对硫磷（1605）、甲拌磷（3911）、内吸磷（1059）后期使用得较多的为高效低毒低残留的品种，如：乐果、敌百虫、杀螟松、倍硫磷毒性极低的马拉硫磷、双硫磷、氯硫磷、锌硫磷、碘硫磷、地亚农、灭蜈松2、有机磷农药18有机磷农药主要品种甲胺磷(CH3O)2PSCCHCOOCH3CH3OCH3SPNHCOCH3OCH3O乙酰甲胺磷19(CH3O)2PSCH2CONHCH3O乐果S(C2H5O)2PNO2O一六0五20•急性毒性：有机磷农药化学性质不稳定，分解快，在作物中残留时间短，大多不溶于水、碱性条件下易水解而失效。•危害：有机磷类农药的中毒特征是抑制血液和组织中胆碱酯酶的活性，导致神经系统机能失调,从而使一些受神经系统支配的脏器,如心脏、支气管、肠、胃等发生功能异常。21•主要表现为植物性食物残留，尤其是含有芳香物质的植物•如：水果、蔬菜，特别是叶菜类如小白菜、大白菜、鸡毛菜、甘蓝、芹菜、韭菜、芥菜、花菜、绿花菜、茼蒿、枸杞菜和黄瓜等223、氨基甲酸酯类农药•是目前使用量较大的杀虫剂。•品种：西维因、杀灭威、速灭威、叶蝉散等•在作物上的残留时间为4d，在动物的肌肉和脂肪中的明显蓄积时间约为7d•特点：分解快、残留期短、低毒、高效、选择性强•危害：同有机磷农药23氨基甲酸酯类农药是农药急性中毒的主要原因，也是时下蔬菜中农药残留的重点检测品种。氨基甲酸酯类农药的中毒原因与有机磷农药相同，也是抑制人体内胆碱酯酶，从而影响人体内神经冲动的传递。氨基甲酸酯类杀虫剂进入人体内，在胃中酸性条件下可与食物中的亚硝酸盐和硝酸盐反应生成亚硝基化合物，具有致癌性。•我国农药在农产品的用量居高不下•导致农产品中的农药残留超标•食品安全、影响消费者健康、影响农产品的贸易•加强农残检测不合理使用分析步骤所需设备1、采集样品2、称取样品分析天平3、捣碎样品高速组织捣碎机4、样品的提取分液漏斗等5、样品的净化SPE、SPME等6、样品的浓缩氮吹仪、旋转蒸发器等7、样品的定性、定量检测GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS等分析步骤所需设备1.采集样品2.称取样品分析天平3.捣碎样品高速组织捣碎机4.样品的提取分离漏斗等5.样品的净化SPE、SPME等6.样品的浓缩氮吹仪、旋转蒸发仪等7.样品的定性、定量测定GC、HPLC、GC-MS等（五）传统农残分析技术一般过程26分析步骤所需设备1、采集样品2、称取样品分析天平3、捣碎样品高速组织捣碎机4、样品的提取分液漏斗等5、样品的净化SPE、SPME等6、样品的浓缩氮吹仪、旋转蒸发器等7、样品的定性、定量检测GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS等优点缺点能够对每一种农药进行准确的定性和定量检验分析周长长检验费用高需要消耗大量的有机溶剂、容易造成环境污染需要使用GC、HPLC等昂贵的大型仪器设备对检验分析人员的化学分析水平有较高要求检验分析过程繁琐、影响因子复杂、不易掌控（六）传统农残分析技术的优缺点27传统的农残化学分析主要是气相或液相色谱等仪器优点：敏感(10－l2～10－6mol／L)、准确缺点：操作复杂、费时及成本高。难以满足需求－－怎么办？－－发展适合我国的快速检测技术28•生化检测•生物检测•化学比色法二、适合我国的农药残留快速检测方法酶抑制法免疫分析法发光菌检测法敏感家蝇检测法速测卡速测仪主要为酶免疫法29酶抑制法酶抑制技术是研究比较成熟、应用最广泛快速的农药残留检测技术，是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE)的特异性生化反应建立起来的农药残留的微量和痕量快速检测技术。301、速测卡法1）原理：•速测卡（即纸片，固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片）•浸提液（pH7.5缓冲溶液，15.0gNa2HPO4·12H2O+1.59gKH2PO4，用500mL蒸馏水溶解）•仪器（常量天平，有条件时配备37℃±2℃恒温装置，专为速测卡法而设计的“农药残留速测仪”和超声波提取器）2）、试剂及仪器预反应速测卡反应加样样本前处理样本制备采样白色药片不变色或略有浅蓝色白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同阳性阴性空白试验确证对照3）、检测流程–整体测定法①选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方片，取5g放入带盖瓶中，加入10ml浸提液，震摇50次，静置2min以上（超声波提取中震荡30秒）。（采样-样本制备-样本前处理）②取一片速测卡，在白色药片上滴上2～3滴提取液。（加样）③在37℃温度中放置10min（有条件时在恒温装置中放置），预反应后的药片表面必须保持湿润。（预反应）④将速测卡对折，用手捏3min，使红色药片和白色药片叠合反应。（速测卡反应）⑤每批测定应设一个缓冲液的空白对照。有条件时，将纸片插入“农药残留速测仪”自动恒温、定时观察。4)、检测方法（整体测定法、表面测定法）–表面测定法（粗筛法）①选取有代表性的蔬菜样品，擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。②取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。③、④、⑤步骤同上。36速测卡检测结果“-”阴性（蓝色）“+”弱阳性（淡蓝）“++”强阳性（白色）•干扰物质的排除葱、蒜、萝卜、芹菜及番茄汁液，含叶绿素较高的蔬菜，不要剪得太碎。测定番茄时，可将提取液放在茄蒂处浸泡2min，取浸泡液测定。测定韭菜或大蒜时，可整根或整粒放入容器中，加入提取液后振摇提取测定。6)、操作要点•空白对照卡不变色原因：药片表面浸提液少、表面不够湿润，和/或是温度太低。•反应时间和温度的控制–当T＜37℃，酶反应的时间相对延长。–样品放置时间应与空白对照卡放置时间一致（可比性）–叠合反应的时间3min(3min后的蓝色加深，24h后退色）6)、操作要点速测卡技术指标•符合率据报道，在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱验证，阳性结果的符合率在80%以上。•检出限速测卡法检测常见农药的检出限与国家允许蔬菜中最大残留限量（mg/kg）比较。（附表）附：速测卡对几种常用农药的最低检出限与最大残留限量比较（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）残留限量（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）残留限量（mg/kg）甲胺磷1.7不得检出敌敌畏0.30.2对硫磷1.7不得检出敌百虫0.50.1水胺硫磷3.1不得检出乐果1.31.0马拉硫磷2.0不得检出西维因2.52.0久效磷2.5不得检出好年冬1.0不得检出乙酰甲胺磷3.50.2呋喃丹0.5不得检出412、速测仪原理:在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质。用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。42农药残留快速测试仪43速测仪检测结果判定依据说明抑制率小于等于50合格抑制率大于50超标，说明含有有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制率与农药残留量成正相关，抑制率越高说明残留量越高44免疫分析技术•免疫分析技术是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量分析技术，是基于抗原抗体特异性结合和反应为基础的分析方法。•目前应用于农残检测的是酶免疫分析(EIA)和放射性免疫分析(RIA)。其中酶联免疫分析技术应用最为普遍。453、酶联免疫技术ELISA是一种以酶作为标记物的免疫分析方法，也是目前应用最广泛的免疫分析方法之一，它将酶标记在抗体／抗原分子上形成酶标抗体／酶标抗原，酶作用于能呈现出颜色的底物，通过仪器或肉眼进行辨别。46•ELISA法基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。•该法因不需昂贵仪器设备