大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competentcells)：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100ml量筒和100ml烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10gPEG(MW=3350)，5mlDMSO，5ml的1M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种—Dh5α，用于接种并振荡培养。两个锥形瓶，分别装有30ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种，其余做转化用。二、感受态制备程序前一天晚上调单菌落至30mlLB中过夜培养（12-16h），按1：100比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50mlLB培养液中，于37℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40～50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5ml）的1×TSS液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100μl/份，全部冰上操作，-80℃保存。三、转化取一管（100μl）感受态细菌，（冻存细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5μlDNA（0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。方法二：CaCl2法细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH5α），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。14．将平板置于室温至液体被吸收。15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。方法三：CASsuperOne-StepCompetentCellPrepsKit采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃，无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。一、准备工作1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37℃过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5mlLB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。2．次日从5mlLB培养物吸取200μl转入50mlLB培养基中（250ml锥形瓶），37℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。二、感受态细胞的制备3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。4．加入100μl预冷的SolutionA，悬浮菌体，冰浴30分钟。5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。三、细胞转化6．在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃1分钟热击，再次冰浴2分钟。加入0.9mlLB培养基，20μlSolutionB，37℃，振荡培养1小时。7．取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。8．过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。补充说明：1．所用器具一定要清洁。2．操作步骤2中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基。3．在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2，效果会更好一些。4．为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6。5．制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作。6．细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。方法四：CaCl2法1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。2、取0.1ml过夜培养物转种于含10mlLB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3。3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液。5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min。6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液。7、将菌体悬浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。方法五：1、将1ml过夜培养的细菌（如DH5α、TG1、TM101）接种于100ml2×YT培养于500ml三角瓶。于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。2、将培养物放于冰上冷却10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。3、弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mmTris•HCl（pH8.0）无菌冰预冷液体中。4、将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。5、弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl2和10mMTris•HCl（pH8.0）无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。方法六：TSB法1、药品制备1MMg2+(1MMgSO4和1MMgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。TSB液（30mL/80mL菌液）（现配现用）：PEG33503gTryptone0.3gYeastextract0.15gNaCl0.3g以上121℃,15min灭菌后，加入1MMg2+600uL,以及DMSO3mL。2、制备步骤（1）活化菌株（2）挑单菌落培养于5mL的液体培养基中。（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养。（4）370C培养3-4小时，OD600在0.4-0.6。（5）离心，去上清。（6）加入20mLTSB，重悬。（7）离心，去上清。（8）加入10mLTSB，再加入15-20%的甘油，分装保存。注：整个操作过程均应在冰上进行；所用药品均需灭菌。3、转化程序（1）取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常≤50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min。（2）将管放于42℃水浴中2min。（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h，干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。（4）每200μl转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于30～37℃培养箱中18～22h。克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。方法七：Inoue法制备超级感受态细胞越干净越好，越冷越好。1、将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。用Milli-Q水配置250mlLB液体培养基。高压灭菌。2、准备两盒1.5mlEP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。高压灭菌。3、于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5mlMilli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。可以用一个新的50ml进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。4、晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250mlSOB培养基（无抗性）中，18-22℃，200rpm