枯草芽孢杆菌表达手册-个人翻译中文版

枯草芽孢杆菌表达载体产品信息和说明2005年11月目录1.简介.........................................................................................32.pHT载体...............................................................................32.1.pHT01载体图谱.................................................................42.2.pHT43载体图谱.................................................................52.3.pHT01衍生物中标签的定位.............................................53.实验方案...............................................................................64.参考文献...............................................................................65.订单信息，运输和存储.......................................................6本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈·舒曼实验室开发。仅用于科研！本手册由wy135033405翻译百度文库首发任何意见请PM枯草芽孢杆菌表达载体通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内/胞外重组蛋白1.简介革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人知。在所有革兰氏阳性菌中，枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目。（一）无致病性，且一般认为安全的有机体；（二）无明显的密码子偏好性；（三）可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中（目前，大约60％的市售酶由芽孢杆菌生产）；（四）具备包含转录，翻译，蛋白质折叠、分泌机制，遗传操作和大规模发酵的大信息量机体。但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用：（一）产生一定数目的识别并降解外源蛋白的胞外蛋白酶；（二）载体质粒稳定性。第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解决。第二个因引入使用θ-复制模式质粒被完全克服，如由天然质粒pAMβ1和pBS72衍生的一些质粒（Jannière等，1990；Titok等，2003）。最近，基于大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72的四种不同表达载体的构建和使用展示出全面的结构稳定性，业已出版（Nguyen等，2005）。两个新的载体pHT01和pHT43允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，其中pHT43载体引导重组蛋白到培养基。这两个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌groE操纵子通过添加lac操纵子改造成为一种高效可控的（IPTG诱导的）启动子。pHT01衍生载体可与8×His标签（pHT08），链球菌标签（pHT9）或C-Myc的标签（pHT10）相结合。2.pHT载体所有在枯草芽孢杆菌的groESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通过加入IPTG进行诱导。尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低，还是成功从约1300种诱导因子中筛选出一种来使用bgaB报道基因（Phan等，2005）。当分别将htpG和pbpE基因融合到groE启动子时，加入IPTG后，表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的10%和13%（Phan等，2005）。热纤梭菌的amyQα-淀粉酶和纤维素酶A、B的高水平表达实验证实。该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点（BamHI,XbaI,AatII,SmaI）。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01的SD序列融合，构成了pHT43，以此获得分泌的重组蛋白。2.1.pHT01载体图谱Pgrac:Pgrac启动子（包含groE启动子；lacO操纵子和gsiBSD序列）CoIE1ori:CoIE1起始子AmpR:青霉素抗性基因LacI:lacI基因(lac抑制子)CmR:氯霉素抗性基因完整的DNA序列可根据要求提供2.2.pHT43载体图谱Pgrac:Pgrac启动子（包含groE启动子；lacO操纵子和gsiBSD序列）CoIE1ori:CoIE1起始子AmpR:青霉素抗性基因LacI:lacI基因(lac抑制子)CmR:氯霉素抗性基因SamyQ:amyQ信号序列完整的DNA序列可根据要求提供2.3.pHT01衍生物中标签的定位pHT08中8×His标签的定位pHT09中Strep标签的定位pHT10中c-Myc标签的定位3.实验方案对大肠杆菌和枯草芽孢分子遗传操作（生长，转化等）的详细协议可以在有关实验室手册如Sambrook和Russell（2001年）中可以找到。对于枯草杆菌改造我们推荐Anagnostopoulos和Spizizen（1961）的方案，需稍加修改：1．20mLLS培养基（Spizizen培养基*补充加入0.5%葡萄糖，5μg/mLDL-色氨酸，5μg/mL尿嘧啶，0.01%干酪素水解物，0.1%酵母提取物[Difco公司]，1mMMgSO4，2.5mMMgCl，0.5mMCaCl）中接种在HS培养基（Spizizen培养基*补充加入0.5%葡萄糖，522μg/mLDL-色氨酸，5μg/mL尿嘧啶，0.01%干酪素水解物，0.1%酵母提取物[Difco公司]，8μg/mL精氨酸，0.4μg/mL组氨酸，1mMMgSO）中37C过夜培养的5mL中的1mL，30C缓慢摇3到4小时。4oo2．用10μL的0.1MEGTA室温孵育这1mLHS培养物5分钟（对数晚期/稳定早期；OD）而后加入1~2578μg质粒DNA。3．37oC摇2小时供其发展抗生素抗性后将细胞涂布至选择性平板。*Spizizen培养基配方：2gNH4SO4，14gK2HPO4，6gKH2PO4，1g柠檬酸钠；加100mL蒸馏水，高压灭菌，然后再加0.1mL1MMgSO4。4.参考文献Anagnostopoulos,C.andSpizizen,J.(1961).RequirementsfortransformationinBacillussubtilis.J.Bacteriol.81:741-746.Jannière,L.,Bruand,C.andEhrlich,S.D.(1990).StructurallystableBacillussubtiliscloningvectors,Gene87:53-61.Nguyen,D.H.,Nguyen,Q.A.,Ferreira,R.C.,Ferreira,L.C.S.,Tran,L.T.andSchumann,W.(2005).Constructionofplasmid-basedexpressionvectorsforBacillussubtilis.Plasmid;inpress.Phan,T.T.P.,Nguyen,H.D.andSchumann,W.(2005).Novelplasmid-basedexpressionvectorsforintra-andextracellularproductionofrecombinantproteinsinBacillussubtilis.ProteinExpr.Purif.;inpress.Sambrook,J.andRussel,D.W.(2001)MolecularCloning:Alaboratorymanual.Titok,M.A.,Chapuis,J.,Selezneva,Y.V.,Lagodich,A.V.,Prokulevich,V.A.,Ehrlich,S.D.andJannière,L.(2003).Bacillussubtilissoilisolates:plasmidrepliconanalysisandconstructionofanewtheta-replicatingvector,Plasmid49:53-62.5.订单信息，运输和存储订单号PBS001PBS002PBS003PBS004PBS005描述pHt01载体，冻干DNA质粒pHt43载体，冻干DNA质粒pHt08载体，冻干DNA质粒pHt09载体，冻干DNA质粒pHt10载体，冻干DNA质粒含量10μg10μg10μg10μg10μg室温运送。冻干质粒4oC储存。无菌水或缓冲液中解旋的DNA我们建议-20oC保存。