细胞形态学检查

细胞形态学检查一、倒置显微镜观察细胞的形态（一）一般的形态学观察：（二）用相差显微镜观察细胞的形态（三）荧光显微镜观察细胞的形态和结构IdentificationofculturedadultratRGCs.Culturedcellswereco-labeledwithanti-Thy-1antibody(A),anti-NF-Lantibody(B),andDAPI(C).(D)Adigitallymergedimagesimultaneouslyrepresentsallthreefluorescentlabels.(E)Thecorrespondingphase-contrastimage.免疫荧光染色法用于标记二抗体的荧光素：（1）异硫氰酸荧光素（FITC）发射的荧光波长为490～619（绿色荧光）（2）四乙基罗丹明：荧光波长为540～660（橙红色荧光）（3）DAPI或Hoechst33258:染核，用紫外激发免疫荧光的染色步骤1、用95%乙醇固定细胞10-30分或用冷丙酮固定5～10分。2、用PBS洗3次。3、用PBS配制的1‰Triton10分。用PBS洗3次4、用2%～5%BSA封闭2小时5、加入一抗过夜，PBS洗3次6、加入二抗1～2小时，PBS洗3次7、核复染，荧光显微镜观察。正常细胞和组织的培养一、上皮细胞培养(epithelialculture)上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。表皮细胞培养1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。CulturedMouseMammaryEpithelialCells神经胶质细胞培养神经细胞（神经元〕不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。CulturedneuronCulturedmicroglia大鼠肝细胞的培养(成年)培养液:Koga培养液,最好加入Williams和WaymouthMB752/1)消化液:型胶原酶300U/mg,使用浓度为0.025%方法:1灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔插管静脉插管2、用预灌流液(8.3mg/mlNaCl,0.5mg/mlKCl,2.4mg/mlHEPES,pH7.4)灌流8分钟3、用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中加入5mmol/LCaCl2,0.05%胶原酶)继续灌流10分钟。4、将肝叶剪下,将消化好的肝细胞轻轻刮下,获得的肝细胞悬液离心(600r/min)三次,每次2分钟5、然后重新悬浮于WE培养基中(含10%血清,Insulin0.2U/ml,L-Glutamine0.292mg/ml，100nMdexamethasone)。6、IsolatedcellswereplatedoncollagentypeI-coateddishesinmediumIconsistingofWilliams‘mediumE。HepatocyteIsolationandCultureHepatocyteswereisolatedfromtheliveroffedmaleBALB/cmice(22-25g)byusingthetwo-stepcollagenaseperfusionmethod.Aftertheinductionofanesthesiawithpentobarbitalsodium(400mg/kgip),theperitonealcavitywasopened,andtheliverwasperfusedinsituviatheportalveinfor4minat37°Cwithcalcium-freeHEPESbufferandfor7minwithHEPESbuffercontaining45mg/100mlcollagenaseD(Boehringer-Mannheim,Laval,QC,Canada)and135mg/100mlCaCl2.Theperfusionratewassetat5ml/minforbothsolutions.Thecellswereusedonlyifcellviability,asdeterminedbytrypanblueexclusion,was80%.Thecellswereseededontoplasticpetridishes(26,000cells/cm2)inWilliams'mediumE(GIBCOBRL,Toronto,ON,Canada)supplementedwith10%fetalbovineserum(GIBCOBRL)andallowed90mintoattach.Theserum-containingmediumwasthenremoved,andthecellsweresubjectedtodifferentcultureconditionsinserum-freemedium.Fig.5.MorphologyofEGF-treatedmousehepatocytesinthepresenceandabsenceofPD-168393.Primarymousehepatocytecultureswereincubatedwithmedium(untreated)orEGF(50ng/ml)inthepresenceorabsenceof10µMPD-168393.After24hinculture,EGF-treatedhepatocyteswerespread,andtheircellsurfaceincreasedcomparedwithuntreatedcells.HepatocytestreatedwithEGFinthepresenceofPD-168393werespheroidandresembledcontrolcellswithorwithoutPD-168393.Magnification,×100.大鼠心肌细胞的培养新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长.大量观测表明,选择13d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.神经细胞分散培养（一）选材常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。(二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。（四）抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。Neuronalculture1.Ratpupsagedl-l5d,werekilledbycervicaldislocation.2.CortexplacedinEarle’sbalancedsaltsolution(BSS)at37°C.andcutinto500urnslices3.Slicesofvisualcortexwereincubatedat37°Cwithgentlestirringin10mlofenzymesolution4.After1.5hr.thesliceswererinsedbrieflywithEarle’sBSScontainingBSA,1mg/ml.5.Theslicesweregentlytrituratedwithafire-polishedPasteurpipetin2-3mlofthissolution.FreshlydissociatedcellsthatexcludedthedveErythrosinB(Phillips,1973)wereconsideredtobeviable.Dissociatedcellswereharvestedbylow-speedcentrifugation(10min,70xg)through5mlofEarle’sBSScontainingBSA(10mg/ml).Cellswereresuspendedingrowthmediumandplatedinmodifiedpetridishes.Typically,cellsfromasingleratpupwereusedtop