生物素标记蛋白操作方法

抗体生物素标记操作方法一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10mg/ml的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2mg/ml的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。一、试剂和器材：1、标记反应溶液：0.1MpH7.2PBS（0.15Msodiumchloride）NaCl8.77g；Na2HPO4·12H2O32.3g；NaH2PO4·2H2O4.5g；加双蒸水900mL左右，用HCl/NaOH调pH至7.2，最后定容为1000mL2、10mMNHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mgNHS-dPEG4-Biotin（分子量为587），溶解于95µl超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置200nmol/L储备液：20mgNHS-dPEG4-Biotin溶解于170µlDMSO中，-20℃稳定几个月。由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5mlEP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。3、超滤管⑴、Millipore超滤管[0.5ml10KD]:截留分子量10KD，残留体积200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心10min。⑵、Millipore超滤管[0.5ml50KD]:截留分子量50KD，残留体积80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心5min。⑶、AmiconUltra-0.5ml离心超滤管（Millipore），效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。二、抗体超滤处理标记前需要应用截留分子量为50kDa的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。具体操作步骤：1、于超滤柱中加入200μl标记反应溶液，加入500ug单克隆抗体，混匀。2、4℃，6000rpm，离心2min。弃滤液。3、于超滤柱中加入100μl标记反应溶液，混匀。4℃，Max14000×g，2min。4、重复步骤26到7次。5、混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。6、将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，1000×g，2min，收集滤液。7、取50μlPBS于超滤柱中混匀，静置1min。8、倒置超滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml（0.25ml）。三、生物素标记抗体1、计算抗体标记需要生物素用量。抗体浓度2mg/ml时的简要计算：1mLof2mg/mLIgG(150,000MW)需要26μLof10mMNHS-PEG4-Biotin具体计算方式见附录一（标记生物素计算）2、超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。3、葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)：四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：（一）、试剂：1、纯化柱处理液:100mmol/LNa0H;2、纯化柱平衡液:50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含0.5gNaN3，8gNaCl;3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;4、标记抗体保护液（50×）:10ml0.01MpH7.2PBS中加入0.5gBSA，0.2gNaN3。（二）、凝胶过滤：方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”五、标记抗体的长期保存方法将“标记抗体保护液（50×）”加入到标记抗体溶液中，使BSA终浓度为0.1%，4℃或-20℃保存。六、数据记录：抗体浓度：mg/ml加入抗体体积：µl标记前抗体体积：µl加入NHS-PEG4-Biotin体积：µl纯化柱规格：cm×cm凝胶体积：ml加入标记抗体体积：µl所有洗脱溶液1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：管号1234洗脱液体积A280管号5678洗脱液体积A280管号9101112洗脱液体积A280附录：一、标记生物素计算：1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：Sulfo-NHS-BiotinMW：5892、10mmol/LSulfo-NHS-Biotin配方：3、标记生物素计算加入体积计算：Sulfo-NHS-Biotin：抗体抗体浓度10-12mg/ml时12抗体浓度4-7mg/ml时16抗体浓度1-3mg/ml时20抗体浓度0.5mg/ml时50Sulfo-NHS-Biotin（mg)PBS（µl)Sulfo-NHS-Biotin（mg/µl)0.5695.10.00589计算公式抗体浓度2mg/ml时*抗体浓度（mg/ml）4.5抗体加入量（ml)0.11抗体加入量（mg)抗体浓度×抗体加入量0.495抗体的毫摩尔数（其他蛋白注意分子量）抗体加入量/15000000.0000033需要的活化Biotin量（mmol）抗体的毫摩尔数×200.000066活化Biotin量（mg）Sulfo-NHS-Biotin量（毫摩尔）×5890.038874需要10mmol/L活化Biotin体积（µl）活化Biotin量（mg）/活化Biotin浓度（mg/µl)6.6