01-申建波-田间作物根际过程定量化

中国农业大学资源环境与粮食安全中心田间作物根际过程定量化申建波([e-mail])第一届全国高产高效现代农业理论与技术培训班2013年7月15日根际的意义及作用根际过程的类型根际过程定量化方法主要内容研究的尺度/因素/问题因素确定最重要因素，田块尺度以2-3个为宜，不超过3个因素；否则需筛选试验。尺度越小，问题就越需要SharpandFocus,最好把一个因素的不同水平效应和作用机制揭示出来。方法研究方法依赖于目的根际是什么？根际（Rhizosphere）一词最先由德国科学家LorenzHiltner在1904年提出，用以描述受豆科植物根系影响的土壤微域，在这个微域内微生物的数量远远高于土体（Hiltner,Onnewexperiencesandproblemsinthefieldofsoilbacteriologywithspecialreferencetogreenmanureandfallow,1904）。(Hinsingeretal.,2009;Shen,unpublished)根际（Rhizosphere）是指受植物根系生长影响，在物理、化学和生物特性上不同于原土体的土壤微域，是植物-土壤-微生物三者相互作用的场所，也是各种养分、水分和有益或有害物质进入根系参与食物链物质循环的门户，是一个特殊的生态系统。根际根自然生态系统中根系/根际过程对植物生长和养分吸收的贡献达100%热带雨林落叶阔叶针叶林荒漠草地高投入1.资源利用2.粮食安全3.环境健康生态效应地下水养分和污染物根际根际的意义和作用根际过程的类型根际过程定量化方法主要内容土壤水分、养分H+H+H+R-COOHAPase根际过程根系形态－吸收面积根际化学－分泌物pH根际生物－菌根菌根际调控根际范围根系特性、根系长度菌根菌根际强度分泌物种类、浓度养分组成与数量根际互作间套作根/土界面动态•根系生长•酸碱反应•氧化还原反应•养分的富集与亏缺•根分泌物•固氮菌、解磷钾菌•菌根（VAM、EMA）•病原微生物•促生菌(PGPR)•根际微生物分泌物关键根际过程:(Hinsingeretal.,2005)根际过程的类型物理过程化学过程生物学过程水分变化团粒大小气体变化（根系呼吸）pH（酸碱变化）Eh（氧化还原状况）配合反应（螯合作用）根系的形态学变化根系的生理学过程（根系分泌物）根际共生生物（固氮菌、菌根、微生物）（根系分泌物）根际的意义及作用根际过程的类型根际过程定量化方法主要内容根土界面（Shangzhuangstation,2013）如何进行根际取样：同一发育阶段和部位1、侧根密度2、侧根长度3、根直径4、根毛长度和密度5、根际土测定可获得参数：根际土的收集方法：1、刷根法：用柔软的毛刷将根际土轻轻的刷下来，收集后储存。这种收集方法优点是保持的土壤物理性质，特别是土壤中的养分浓度；缺点是收集时间过长，土壤与根系长时间暴露在空气中，土壤中有机物质变化较大。2、涮根法：将整个根系装入事先装有一定体积的0.2mmolL-1CaCl2溶液的烧杯中浸提，在浸提过程中轻轻将根系浸入溶液并摇动，使尽可能多的根际土溶入浸提液中。这种收集方法的优点是收集时间短，然后将土壤迅速保存在适宜的储存环境，保持土壤中有机物质的量与活性；缺点是如果根系损伤较严重，则受根系组织液的影响较大。根际样品采集——根际土的收集方法根系从土壤中取出后，轻轻抖动去掉松散的土壤，这些土壤被认为是土体土，紧紧地粘附在根系的土壤被定义为根际土。土体土根际土(申建波等，植物营养研究方法，2011)注意：近根际土的获得植物根际根系研究的重要方法-Rhizobox根箱根箱是一种很好的研究作物根系分布的试验装置同时也是最直接的对根际过程进行原位研究的试验装置Collectiontime:2h300uLwaterextractionCleanfilterpaperHPLCdeterminationCentrifuge根际样品采集——田间根窗的应用将根箱的研究优势引入到田间试验——根窗根窗的安装过程是：1、用铁板在田块内制作出一个土壤剖面；2、用透明的树脂玻璃板替代铁板的位置；3、在避光后便可在后期观察到根系在剖面上生长的情况，同时也可以对田间根际过程进行原位研究。(Neumannetal.,2009)根际样品采集——根际溶液的收集方法（Micro-suctionCups）微量提取探头密封胶(ShenandHoffland,2007)微量提取探头（Micro-suctionCups）是一种直径很小（最小可到1mm）的带微孔的陶瓷探头。可以利用微量提取探头结合根箱，根据作物根系生长的情况，将微量提取探头直接插入到根际土壤附近，通过负压直接提取根际土壤溶液。取样点利用刷根法取到的根际土按照标准方法测定土壤pH与Eh根际pH与Eh田间根际pH与Eh的原位测定利用涮根法取到的根际土也可以直接利用浸提液测定pH值，但是由于水土比不同需要利用同种土壤制作pH与水土比的校准曲线，换算后进行比较使用微型pH（Eh）探头，直接接触到根际位置，测量根际pH（Eh）。也可以使用微量提取探头提取的根际溶液直接测定。由于pH与土壤水分也有关系，因此这种方法同时要测定土壤含水量，同样需要相应的校准曲线。根际pH变化不同类型的微型pH探头田间测定根际pH的演示(Jingetal.,2010,2012)质外体pH荧光定位显色利用共聚焦显微镜与荧光指示剂原位定位指示根际的质外体pH值将需要测定的处理好的根系放入含有0.05mMCl-NERF-dextran和0.04mMTexasRed-dextran的固定液中，固定染色30s后，用载玻片装载后在共聚焦显微镜下观察。Cl-NERF和TexasRed分别在488nm和568nm的krypton-argonlaserlines（氪氩激光）下激发，散射光在525nm(Cl-NERF)和585nm(TexasRed)在采集。(Yuetal.,2001;Tanginpreparation)根际低分子量有机酸测定玉米小麦大豆鹰嘴豆酒石酸苹果酸柠檬酸琥珀酸反丁烯二酸反乌头酸标准品将涮根法中的浸提液过0.45μm滤膜或微量溶液提取器取到的溶液使用液相色谱仪进行测定（Shenetal.,2003;Wangetal.,2007;Lietal.,2010;Tangetal.,2013）。测定的体系条件是250mm×4.6mmC18反相柱（AlltimaC-185µ），流动相为25mmol/LKH2PO4（pH2.25），流速为1ml/min，温度为31℃，测定波长为214nm，进样量为20µL根际氨基酸测定利用抽取的根际溶液（反应需要至少20μL）进行反应测定。原理是游离的氨基酸会与邻苯二甲醛及巯基乙醇反应生成能产生荧光的硫代异吲哚，分别在340nm（激发波长）与440nm（发射波长）测定，可计算氨基酸总量试验的操作过程是在设定好上述两个波长后将光束的宽度设定在10到20nm，向反应池内加入20μL样品，再加入2mL邻苯二甲醛及巯基乙醇的反应试剂，反应1min后读数即可（Jonesetal.,2002）。根际氨基酸测定利用抽取的根际溶液（反应也需要至少20μL）进行反应测定。AccQ•Tag法是Waters公司开发的一种氨基酸分类测定方法，使用WatersAccQ•TagFluor衍生剂（AQC,即6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基酸基甲酸酯）能与所有含氨基的化合物发生快速、定量反应，过量的AQC可在1min内水解为不干扰测定的AMQ，生成稳定的衍生物，可在HPLC上使用AccQ•Tag专用柱或其它性能较好的C18柱分离，用萤光检测器或紫外检测器检测（Waters，1997）。可将生物体内所有20中α氨基酸进行分离。磷酸酶可以将对硝基苯磷酸二钠（pNPP）的磷酸基团脱去，生成对硝基酚（PNP），此物在碱性环境中显黄色，在酸性环境不显色，而pNPP在酸碱性环境中均不显色。可将反应后的溶液在405nm波长下显色，通过定义反应生成PNP的量从而定义酸性磷酸酶的相对活性。试验过程是将0.5mL涮根法收集的土壤悬浊液加入2mL的离心管中，加入0.4mLpH=5.2醋酸钠缓冲液和0.1mL150mMpNPP溶液，放入30℃的恒温箱内培养60min。反应结束时用0.5mL0.5M的NaOH终止反应。离心后在405nm的波长下比色。将缓冲液换成pH7.8的0.1MTrizma（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液可测定碱性磷酸酶的活性酸性磷酸酶30℃pH5.2根际磷酸酶活性测定（Alveyetal.,2003）采用具有蓝色荧光的底物ELF-97探针，该底物在磷酸酶的作用下，发生水解反应，形成附着于磷酸酶上的绿色荧光沉淀，从而原位检测磷酸酶。用相应pH的缓冲液（过0.22μm滤膜）稀释ELF-97底物溶液20倍,漩涡混合几秒后，通过0.22μm水系滤器。太高的浓度会导致标记过量，太低的浓度由于延长的反应时间，从而导致过量的背景染液标记。根部原位磷酸酶荧光定位切取0.5-1.0cm长的根段，冲洗3次，放入已稀释好的底物溶液中标记1min，取出，用清洗缓冲液（pH8.030mMTris，1.5MNaCl，0.05%w/vTritonX-100）冲洗3次，放于载玻片上，加载装载介质（ELF-97EndogenousPhosphataseDetectionKit提供）放样品于载玻片上，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察拍照，最大激发波长设在345nm，最大发射波长设在530nm。（Tangetal.,2013,J.PlantPhyiol.）根分泌酸性磷酸酶的原位显色把根系置于含有p-NPP底物的琼脂板中培养显色，图像转为假彩色(pseudo-colour).（Tangetal.,2013,J.PlantPhyiol.）利用根盒进行原位监测监测方法是用Neutronradiography（中子射线照射术）给根盒拍照由于射线投射技术要求，根盒内土壤的厚度要小于1.5cm，土壤介质中的有机质含量要尽量低，土壤的膨胀系数要在干与湿变化时极低。根际水分原位监测(Carminatietal.,2010)第一天第六天（灌水）第四天第五天第三天第二天根际氧气浓度原位监测利用根盒进行原位监测监测方法是能与O2发生反应的荧光染料和Neutronradiography（中子射线照射术）结合给根盒拍照荧光染料要附着在一层塑料的半透膜上厚度一般为10μm，制作方法是将20mg的platinum(II)5,10,15,20-tetrakis(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)porphyrin（一种铂的朴琳化合物）与1.98g的聚苯乙烯用18g甲苯溶解，过夜后倒板定型t1t2t3t4Oxygenpatternstructuredporousmedia(mg/l)t1-t2随着反应时间延长氧气减少的量和区域扩大t2-t4随着土壤水分的散失，到第三天呼吸作用减弱，消耗氧气量减少010(Rudolphetal.,2012)研究方法部分参考文献申建波、毛达如主编.2011.《植物营养研究方法》（第三版），中国农业大学出版社，北京。张福锁、申建波、冯固等著.2009.《根际生态学》，中国农业大学出版社，北京。CarminatiA,MoradiA,VetterleinD.2010.Dynamicsofsoilwatercontentintherhizosphere.PlantandSoil.332:163–176.JonesDL,FarrarJF,OwenAG.2002.Simplemethodtoenablethehighresolutiondeterminationoftotalfreeaminoacidsinsoilsolutionsandsoilextracts.SoilBiologyandBiochemistry.34:1893-1902.NeumannG,Ge