灰度值和光密度值在免疫组化定量分析

灰度值和光密度值在免疫组化定量分析免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权威的说法。现在可以查到无数篇应用图像分析来分析免疫组化的文献，但几乎没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。居然经常能看到其他颜色的免疫组化照片，这肯定是样品制作过程中有了差错。用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。使用图像分析软件定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。切片上阳性反应物量是由图片上黄色染色的深浅与面积一起表现的。所以最终要测量的就是图片上黄色部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。就是把图片上每个黄色的象素点的强度值全部累加起来得到的值。IOD除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。这个面积可以就是照片的面积，也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄色的区域的面积。必须根据切片的实际情况来适当选择。对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝色复染，所以需要另一种分析方法。将另作讲解。这张照片曝光稍大。但仍能表现出免疫组化的黄色染色与细胞核的蓝染。在拍摄照片时，需要注意的地方是：１.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。这样才能测量出正确的密度值。２.曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白色背景的亮度，应该在２３０附近。过低过高都不好。3.注意相机白平衡：如果使用的是专业CCD相机，会有校正白平衡的功能，此时应对空视野进行白平衡校正。如果是普通的数码相机，要关闭自动白平衡功能。或者选择阳光模式。避免拍摄的照片因为色偏而偏蓝或偏黄。4.很多显微镜都是同时有荧光附件的，在拍摄荧光照片时要加上滤光片，注意有时候这些滤光片会忘了移开，结果拍摄的照片就会严重偏色。正确地拍摄照片是图像分析的基础，以后的各项应用实例中往往都会先介绍如何拍摄照片。图像分析方法：1.校正图片光密度分析免疫组化照片，第一步就是要校正光密度。照片上黄色点的亮度数值是灰度，黑色为0，白色为255.这与免疫组化强度是相反的。深色深的点，数值应该更大才对。在理论上，图片上的灰度与样品阻挡光线的物质光密度是一个指数关系，对于白色的色点，对应样品透光率为100%，光密度为零。对于黑色的点，对应样品透光率为0，光密度为无穷大，但实际上把这个光密度值定为2.0.校正光密度值就是把程序的光密度值设置成这样的坐标。在carliberationintensity的窗口里点new,然后选择stdoptiondensity.把鼠标放在图片上最白的地方，然后看程序窗口下方的状态栏，会有显示该点的三色各自的灰度值，在其显示的数值中间选择一个差不多的整数，比如230，或220，作为背景扣除值。操作方法是：点option按纽，在弹出的小窗口中的incidentlevel中把默认的255改为230或220.返回就可以了。最后在窗口右上方点一下system把这个校正作为系统光密度值应用于所有图片。这个设定被默认地命名为intensitycal0。光密度校正的窗口不要关闭，可以移到边上放着随时检查。有时候新照片未必会应用上，要重新调出刚才设定的intensitycal0.2.选色。在segmentation中使用HSI模式，选择H:0-30,S:0-255,I:0-230.然后点file--save。HSI的选择范围是可以根据图片情况作微调的。保存这个选色设置。一般放在图片的保存文件夹里。默认的保存文件是rgb24.rge。3.设置分析环境。一个是selectmeasurement。要选择IOD。另外默认的选择area都是要测量的。对area的过滤值，默认为10，实际上还可以大点，设置到25甚至50也行，可以把那些小的杂质点去掉。另一个是option:outline:filledlabelstyle:nonedarkbackgroundonsample:nosmoothing=1filledhole:oncleanborder:none4.保存分析环境。在count/size窗口中点filesavesettings。保存环境设置文件。5测量用irregular工具画出测量区域。这里很关键的一点就是如何画这个测量区域。最普通的情况下，要测量整张照片的光密度，就不必画这个测量区域了。此时会测量照片上全部被选中的黄色的光密度总和（IODSUM），面积就是照片的面积。如果你拍摄的照片上，有个角正处于切片边缘，没有细胞，这就需要把这个角上的空白面积给扣掉了，此时画的“测量区域”就应该沿着样品的边缘来画。另一种情况是，要测量一个癌巢里的蛋白表达，边上正常组织上的表达不算。这时候就要沿着这个癌巢的边界画这个“测量区域”。点count按纽。完事。测量数据在viewstatistics窗口中，读取IODSUM数值，作为这张照片的累积光密度值。其他的数值都是没用的。如果你用irregular工具画了一个“测量区域”，那点count时，程序会只测量“测量区域”内的IOD。外面的不管。在测量数据中显示的area是黄色部分的面积。在很多情况下，这个面积值意义不大。6.测量面积。通常我们需要测量的是一个平均光密度（meandensity）而不是积分光密度(IOD)。上一步已经测量了IOD，现在就要测量area了，再说一遍，上一步的测量数据里的area在通常情况下并不是正确的area。如果测量的是整张照片，area就是照片的面积。如果用irregular画了“测量区域”，area就是这个测量区域的面积。此时只要在count/size窗口中点edit-convertAOItoobject，然后就能在测量数据窗口中看到测量面积了。此时还能看到另一个IOD值，这个值是不能用的，它包括了蓝色细胞核的光密度。7.数值处理：对每一张照片，要测量一个IODSUM，如果选择了测量区域，还要测量一个area。这张照片的测量值一般是平均光密度，它反映了这张照片上免疫反应物的表达强度。meandensity=(IODSUM)/area在测量整张照片的时候，可以只测量IODSUM，在这种情况下，所有照片的面积都是相等的。meandensity与IOD都是个相对值，所以是没有单位的。其实OD值本身就是个比例值。这个词在分光光度计上常用，意思是opticaldensity通常我们有两组实验对象，实验组与对照组，每组有十来个样品，各拍摄几张照片。每个样品拍摄的几张照片测量的meandensity再作一次平均，作为这个样品的meandensity.一个实验组的几个样品测量值可以计算其平均值与标准差，或者直接用T检验去统计两组的统计学差异。把一张照片的测量值当作一个数据也是可以的。再次强调，一张照片只测量一个IOD值或meandensity值，作为这张照片的测量数据。statistics窗口中的其他统计数值不必管它。8.批量测量照片：测量一组照片时，首先用一张比较典型的照片按上面步骤测量。然后在测量其他照片时，必须用这些测量条件来测量。因为已经保存了背景校正、选色文件与测量环境文件，所以在测量时要直接调用这些设置文件。8.1把第一张照片最小化，不要关闭。8.2打开第二张照片，或者一次打开全部照片，激活一张。8.3检查光密度校正窗口，确认应用了光密度校正。8.4在count/size中loadsettings，调出环境设置文件。8.5点selectcolor调出segmentation窗口。确认处于Histograph及HSI模式下。再调出选色文件。8.6需要时用irregular画测量区域。8.7点count测量IOD，记录数据（点statistics中的DDEtoexcel），再点convertAOItoobject测量面积，再记录数据（还是点statistics里的DDEtoExcel，注意，这是两次向excel输送数据，所以事先要在DDEoption中选择appenddatatoend，否则后面的数据会冲掉前面的）。8.8关闭图片，再测量下一张。9.上面的测量步骤有个系统误差。在测量IOD的时候是直接测量彩色照片的IOD，虽然对测量结果影响不大，如果希望测量得细致一点，就需要增加一个将彩色图片转换成黑白图片的步骤。方法是：在选择完颜色后（就是上面的8.5之后），在segmentation窗口里的view下面选择transparantonwhite.可以看见图片上除了黄色外，其他地方都变成白色了。然后点createpreviewimage复制这张效果图片。转换这张图片为8位灰度格式（greyscale8）。在这张灰度图片上用irregular画测量区域（就是按照上面的8.6以后继续作）。对灰度图片还要再作一次选色，此时selectcolor按纽会变成selectranges，只有一个I可以选择，此时选择范围是0-240。这回的IOD测量值与稍大一点。这是正确的光密度测量值。但操作上增加了很多步骤。也不便于编制宏操作进行测量。