综合性实验植物DNA的提取及电泳

本科学生综合性实验报告学号：124120434姓名：刘云谣学院：生命科学学院专业、班级：12生物技术实验课程名称：植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作教师：郝大海开课学期：2014至2015学年上学期云南师范大学教务处编印实验序号一实验名称植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作实验时间第十五周实验室睿智3--428一、实验目的1、了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤2、掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法3、掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法4、了解PCR原理，熟悉操作步骤5、掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法二、实验原理1、DNA提取的原则：（1）保证DNA一级结构的完整性（2）排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等2、在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.3、分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:（1）、用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.（2）、用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.（3）、用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀4、DNA提取方法：（1）CTAB法原理：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl），该复合物可溶。之后用有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，最后在上清液中加入乙醇沉淀DNA。注意CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。（2）SDS法SDS阴离子去垢剂在高温（55～65℃）下裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀，之后上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀水相中的DNA。5、DNA质量检测：紫外分光光度计检测法，嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度。6、琼脂糖电泳：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。7、PCR实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。三、实验设备及材料（一）、仪器设备1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头（盒）；200ul吸头（盒）；10ul吸头（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；试剂瓶；量筒、恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；酸度计；电子天平；PCR仪（二）、试剂CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB（三）、材料：马铃薯叶四、实验方法步骤（一）、DNA的提取；1、取100mg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，加入液氮，研为细粉。加入350μl新鲜2×CTAB缓冲液，再仔细研磨。（CTAB用于抽提DNA）2、350μl新鲜2×CTAB缓冲液，冲洗研磨棒，加入2μlβ－巯基乙醇，混匀。65℃水浴45分钟，每15分钟摇动一次。冷却至室温，静置2分钟。3、每支离心管加入700μl氯仿：异戊醇（24：1）（672氯仿:28异戊醇）混合液。轻柔短暂地混和，避免DNA断裂。颠倒几次。（氯仿、异戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白质）4、在微型离心机中，以14，000rpm离心5分钟。移取上层水层，置于新的、标识好的1.5ml离心管中。注意避免取到中层物质。将氯仿：异戊醇废液倒入废液缸。5、加入50μl10％CTAB（溶于0.7MNaCl），轻柔混和，并保证混和完全。6、重复第3、第4步。7、每支离心管中加入等体积异丙醇（400－500μl）。上下颠倒几次，4℃静置20分钟（或－20℃，15分钟）。（异丙醇用于沉淀DNA）8、14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢失。倒置离心管，空气干燥（1－2分钟）。9、用1ml70％乙醇清洗DNA（3分钟），14,000rpm离心30分钟。小心倒出70%乙醇，用1ml90％乙醇清洗DNA，14,000rpm离心30分钟，小心地倒去乙醇。倒置离心管，空气中干燥，或用真空泵干燥15分钟。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10、以150μlT10E1或蒸馏水溶解DNA，加入1～2μl不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37℃反应1小时。11、4℃保存（－20℃长期保存）。（二）、琼脂糖凝胶电泳1、取5×TBE缓冲液20mL加水至100mL，配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL1×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。4、加样：取10μLDNA样品与2μL6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。五、实验注意事项1、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要专门处理后才可丢弃。2、当EB太多,胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30min后再观察。3、制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀：速度也不可太快，否则容易出现气泡。4、CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。5、注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。6、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；7、蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；8、多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；9、多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；10、盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。七、实验结果及分析（一）、实验结果纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1、OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2、小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3、OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。只有当DNA的OD260/OD280接近于1.8时才值得去电泳。本次实验的结果为：OD260：2.6OD280：1.2OD260/OD280=2.6/1.2=2.1电泳结果如下：条带最多的是DNAmark样本，它的范围在200-4000之间，其他的为实验中提取的DNA经过PCR反应后得到的DNA样品，经过电泳之后就可以通过比较条带的远近和mark条带上的位置，就可以知道经过PCR后得到的DNA了。（二）、结果分析本次实验历时一天，流程复杂，要求高。由于在本次实验中，我们组在有的步骤处理过程中出现一点点意外，故没有提取到较高程度的DNA，在PCR的过程中也就没有得到较好的DNA产物，故没有参与电泳。八、参考文献肖尊安植物生物技术.高等教育出版社,2011.许智宏.植物生物技术.上海科学出版社，2002.指导教师评语签名：日期：年月日