手性药物的生物合成技术研究

手性药物的生物合成手性分离技术手性分离和分析的重要性★获取单一对映体化合物★对于涉及分子手性分析的领域要采用高对映体选择性的分析方法手性分离的特殊性在非手性环境中，对映体的物理化学性质（如熔点、沸点、折射率、蒸气压、溶解度、红外、核磁谱和质谱等）大都相同，这就造成对映体分离的困难。1获得单一对映体的途径手性源(chiralpool)合成前手性底物不对称合成外消旋体拆分防止“外消旋化”“立体选择性”反应，如手性催化、手性诱导、生物催化结晶法衍生法酶法色谱法●天然手性库：从自然界存在的光活性化合物提取得到，如氨基酸、羟基酸、糖、生物碱和萜类等为原料，采用保持原构型、转化或手性转换等方法合成手性化合物●不对称合成：采用手性辅助基、手性配体、手性催化剂对前手性底物进行选择性反应●外消旋体拆分：常规合成方法得到外消旋体产物，如何将它们进一步分离2外消旋体拆分方法等量对映体的混合物，其旋光性相互抵消，没有旋光能力，称为外消旋体。将外消旋体分为对映体的过程，叫做对映体拆分（resolution）。广义地讲，对不等量对映体混合物进行分离，也属于对映体拆分的范畴。2.1结晶拆分法▲Pasteur分离酒石酸对映体1849年，Pasteur首次分离酒石酸对映体，就是利用外消旋的酒石酸铵钠在27℃以下结晶时，形成的晶体是“外消旋混合物”，两个对映体的半面晶外观不一样。Pasteur借助放大镜，用镊子将两种酒石酸铵钠晶体分开。这就是历史上有名的第一个对映体拆分实验。图3酒石酸铵钠晶体外型这一方法虽然古老，但在一些特定的场合还有用处，如“手性金属配合物”。接种晶体拆分法在一个外消旋混合物的热饱和溶液中加入其中的一个纯对映体的晶种，然后冷却，则同种的对映体将附在晶体上析出；滤去晶体后，母液重新加热，并补加外消旋体使之达到饱和，冷却使另一对映体析出。这样交替进行，可方便地获得大量纯对映体结晶。在没有纯对映体晶种的情况下，有时用结构相似的其它手性化合物（有时甚至非手性化合物）作晶种，也能获得成功。（为什么？）晶体形成时的有规律的定向排列，可能自然形成一手性环境。D,L氯霉素的母体氨基醇的结晶拆分示意图D,L-氨基醇水溶液D-氨基醇，80℃冷至20℃D-氨基醇晶体母液80℃浓缩冷至20℃L-氨基醇晶体母液2.2生物拆分法生物酶、微生物、细菌等生物源具有非常专一的反应特性。利用酶可以选择性地使外消旋体中的一个对映体发生反应，如降解，从而达到拆分的目的。因此，这一方法也称为“生物化学拆分法”。1858年，Pasteur就观察到：外消旋酒石酸在酵母或青霉的存在下进行发酵，天然的（+）-酒石酸铵逐渐被消耗，而经过一段时间之后，从发酵液中分离出纯的（-）-酒石酸铵。这是微生物代谢了天然的（+）-酒石酸，而留下了（-）-酒石酸。图5D,L－苯基甘氨酸外消旋体的酶拆分生物拆分特点：立体专一性强、拆分效率高和生产条件温和。目前，酶法拆分已从水溶液向有机介质发展。CH3HOHHH2NNH2D,L-苯基甘氨酸(PG)(CH3C)2-OOD,L-乙酰PGL-氨肽酶L-PGD-乙酰PG水解/H+D-PGD,L-PGH2SO4/加热(外消旋化)用微生物酶拆分外消旋体，比化学拆分法具有明显的优越性：（1）酶催化反应通常具有高度立体专一性；（2）副反应少，产率高，产品分离提纯简单；（3）反应条件较温和，如0~50℃，pH接近中性；（4）酶无毒，易降解，不会造成环境污染，适于规模生产。用酶拆分外消旋体氨基酸特别重要。因为多数合成氨基酸消旋体不易用化学方法拆分，而酶法拆分却非常有效，可用于制备旋光性氨基酸。2.3化学拆分法化学分离的原理：利用合适的分离性质差异来进行分离。常见的化学分离方法：●沉淀与结晶：溶解度●蒸馏：蒸气压●萃取：分配系数●色谱：分配系数这些化学分离方法可用于对映体的拆分吗？化学拆分法原理如果外消旋体的分子含有某些活性基团，如羧基、氨基、羟基和双键等，可让其与某种旋光活性的化合物（称为拆分剂）进行反应，生成两种非对映体。利用非对映体在分离性质上的差别可将其分开。换句话说，化学拆分的原理是将具有相同性质的对映体转变为具有不同性质的非对映体来进行分离。拆分过程一般包括如下三个步骤：(+)-酸(-)-酸+(-)-碱(+)-酸·(-)-碱(-)-酸·(-)-碱(+)-酸·(-)-碱(-)-酸·(-)-碱(-)-碱(-)-酸手性试剂衍生分离非对映体分解或还原单个对映体化学拆分的关键是选择合适的拆分剂和拆分溶剂◆拆分剂（1）容易与外消旋体中的两个对映体结合生成非对映异构体。拆分后，又容易再生出原来的对映体。如酸碱反应。（2）所形成的非对映异构体溶解度有较大的差别，其中之一容易结晶。（3）拆分剂应达到旋光纯。从原理上，拆分后对映体纯度不会超过拆分剂纯度。假定拆分剂(-)-B碱的旋光纯度为90%（即含有10%的(+)-B），被用来拆分(±)-A酸，那么所形成的盐中将有10%的含量。(+)-A酸·(-)-B碱(-)-A酸·(+)-B碱(-)-A酸·(-)-B碱(+)-A酸·(+)-B碱和10%新对映体（4）拆分剂应廉价易得，或可方便回收一些常见的手性拆分剂：碱性拆分剂：（-）-马钱子碱、（-）-番木鳖碱、D-（-）-麻黄碱等；“管制药品！”酸性拆分剂：（+）-酒石酸、（+）-樟脑酸、（+）-樟脑酸-10-磺酸、L-（+）-谷氨酸等。醇类化合物可以用异腈酸酯转变为非对映异构的氨基甲酸酯，也可以用手性酰氯（或酸酐）转变成酯拆分。醛、酮则常用氨或胺的衍生物转变为腙、缩氨脲、肼亚胺等非对映体拆分。DutchResolution（家族拆分剂法）99年9月在英国剑桥召开的国际手性学术会议上，VriesT发展了一种称为“DutchResolution”的新的非对映体结晶方法，大大地扩展了化学拆分方法实际应用。这是一种组合拆分方式，即采用一组类似的拆分剂家族(familiesofresolvingagents)，同时加入到一待拆分的外消旋体样品溶液中。经过沉淀过程，这时析出的非对映体晶体比使用单一拆分剂大得多，甚至其中的一部分拆分剂可采用消旋化合物。参见VriesTet.al.,Angew.Chem.Int.Ed.1998,37:23492.4色谱拆分法如何获得高对映体纯的手性物质在许多领域都是很重要的。色谱法不仅是对映体分析和纯度测定的有力工具，而且液相色谱拆分法还是制备和纯化的重要手段。历史上，曾采用一些天然手性吸附剂，如淀粉、蔗糖、羊毛等成功拆分一些外消旋体。现代制备色谱在拆分外消旋体方面更是发挥更大的作用。如选用拆分能力很强的手性固定相填充剂，用大柱子，一次已能拆分几十克量的外消旋体，并达到99%的旋光纯度。3、高效手性分离技术色谱法和电泳法是一类高效分离方法，但常规的色谱/电泳方法仍不能直接分离对映体。（为什么？）因为在非手性环境中，对映体的分离性质（如沸点、蒸气压、溶解度、分配系数、吸附特性以及淌度）完全相同。如何运用高效色谱和毛细管电泳分离分析对映体化合物？——热力学/分离性质上的差异3.1手性分离基本策略●手性消除采用手性试剂衍生对映体，使之转化为非对映体，利用非对映体间的性质差异采用常规分离方法分离。●构建手性分离环境将手性分离介质引入分离器中构建手性分离环境，使得原本没有分离性质差异的对映体产生分离差异。这些策略也是其他分析技术如波谱法研究手性识别的思路。●结合高效分离技术3.2手性分离原理1）手性试剂衍生法手性消除采用柱前衍生技术，即用光学纯的手性试剂，将对映体衍生成非对映体复合物，这些非对映体复合物具有不同的理化性质，便能使用常规的色谱技术分离。其优点是可将手性消除和检测衍生反应结合起来。除了满足一般的色谱衍生要求的条件外，还要注意：所用的衍生剂应尽可能达到对映体纯；衍生剂不能选择性地与两种基质对映体反应；生成分离性大的稳定的非对映体。衍生后两种非对映体的检测器响应可能不同，不宜按归一化计算对映体纯度。手性试剂衍生位置应靠近对映体样品的手性中心，以求获得最大的分离效果。过大的衍生试剂可能会缩小样品理化性质的差异，造成分离困难。作制备用的手性衍生剂要求它的衍生化和去衍生化反应都容易进行，且总收率要高，生成的非对映体具有更大的分离性（有利于提高制备量）。2)手性色谱手性色谱的原理是通过待拆分对映体与手性固定相之间的瞬间可逆相互作用，根据形成瞬间缔合物的难易程度和稳定程度，经过多次质量交换后，达到对映体间的分离。近年来，高效手性分离技术的发展，导致与有机立体化学相关的手性药物学、分子生物学、材料化学、地球化学、天然有机化学等前沿领域取得许多突破性的发现和发展。衍生法：非对映体的形成是“固定的、永久的”如果设法把手性试剂引入固定相，外消旋体样品流过柱子是否会形成非对映体？与手性衍生法色谱分析不同，对映体组成的测定精度与手性固定相所用的对映体纯度无关（固定相的对映体纯度只影响拆分因子α的大小）。手性色谱可以通过两种方式进行：手性固定相法手性添加剂法手性拆分原理包括主-客体作用、络合作用、配体交换、相分离、离子交换等。核心是分子手性识别作用，即对映体与固定相（或添加剂）间的相互作用涉及到分子立体选择性。三点作用模型相互作用强，保留长，后出峰相互作用弱，保留短，先出峰基体(S)-选择子(R)-溶质②③①基体(S)-溶质(S)-选择子①②手性固定相具有很强的特征性，一个固定相往往只能拆分一类或几类对映体。手性色谱的另一个特点是将Pirkle型手性固定相的手性变成相反构型，可使对映体洗脱顺序颠倒过来。研制新的手性固定相，解决不同类型手性化合物的分离是手性色谱发展的前沿领域。过去100年：拆分约7000种手性化合物手性色谱：已拆分近万种手性化合物液相色谱中的手性固定相已研制100多种手性添加剂法在液相色谱流动相或毛细管电泳的缓冲溶液中加入手性添加剂（CA），CA与对映体溶质通过静电引力和氢键等非共价键结合方式，形成可逆的不同稳定性的非对映体配合物，在非手性分离器中实现对映异构体的分离。手性添加剂是一种直接拆分法，其优点在于不需要化学衍生，也不需要特殊的手性固定相。CA必须能提供有效的基团和位置以便与溶质对映体形成非对映的配合物，也必须具有合适的结构以改善分离性能和提高其立体选择性。常见的CA可分为手性对离子添加剂、手性配位添加剂和环糊精添加剂。TLC分离芳香醇胺对映体用D-10-樟脑磺酸铵作为手性离子对试剂添加到流动相中，在普通的GF254薄层硅胶板(2.5×10cm)2~4℃展开，拆分拉贝乐尔(Labarol)和倍他乐克(Batarock)两种芳香醇胺药物对映体。(a)LabarolCH2Cl2-CH3OH(67:33)，含D-樟脑磺酸铵6.8mmol/L(b)BatarockCH2Cl2-CH3OH(60:40)，含D-樟脑磺酸铵6.8mmol/L（李高兰等，色谱，1999，17：216）a.Labarolb.BatarockHPLC拆分氧氟沙星国内使用外消旋的OFLOXCIN,而日本已开发左旋氧氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。6mmol/Ll-phen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，Shim-ParkPREPODS(20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)-OFLNNNOFOCOOHCH3H3CCu2+COOHH2NS-(-)-OFLR-(+)-OFL若改用d-phen,出峰顺序可能发生逆转！环糊精结构OHOHHO甲基化3.3手性色谱技术★气相色谱★高效液相色谱★毛细管电泳★超临界色谱3.3.1气相色谱GC具有快速、灵敏、简便和定量准确等优点。手性GC特别适合于不对称合成的样品分析。因为分析样品一般无需衍生，反应产物可直接进样分析，用量极微（10-8g），特别适合于跟踪不对称反应的全过程。对于那些对映体纯度95%的产物，一般要用GC或HPLC代替旋光测定。气相色谱手性固定相主要分为：●氢键型手性固定相：如某些氨基酸衍生物固定相，主要用于分离氨基酸、羧酸、醇、胺、内酯、内酰胺等对映体化合物，