实验九-水中总大肠菌群的测定

实验九水中总大肠菌群的测定一实验器材1培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基、伊红美兰琼脂平板2溶液和试剂革兰氏染色液3仪器和其他用品高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角瓶、接种环二目的要求1学习检测水中总大肠菌群的方法。2了解检测水中总大肠菌群各种方法的原理及其应用中的优、缺点。3了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。实验八水中总大肠菌群的测定三基本原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数简称MPN表示。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数（mostprobablenumber,MPN)表示。四培养基的配制（1）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分装于试管中，每个试管10ml，倒置一德汉氏小管，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。（2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水外，培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管5ml。（3）伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏水溶解，115℃高压灭菌15min，待冷却至45℃—50℃，倒平板待用。培养基配制操作图示：用漏斗分装培养基及摆斜面培养基的分装：一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。◆包扎1．培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。2．吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。3．三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45º角，并将右端多余的报纸打一小结。4.玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160－170℃灭菌2h.1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热。3.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。◆灭菌高压蒸汽自动灭菌锅手提式高压蒸汽灭菌锅倒平板操作法示意图斜面摆放与冷凝五操作步骤1水样的采取（1）检测自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。（2）检测池水、河水或湖水应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即检测，否则需放入冰箱中保存。3初发酵试验（1）生活饮用水在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。（2）水源水在装有5ml3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL1：10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养48h。（可以根据水的污染程度选择3个稀释度）4分离培养将初发酵的阳性管(产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养基平板。置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态。选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:①深紫黑色，有金属光泽；②紫黑色，不带或略带金属光泽；③淡紫红色，中心颜色较深,挑取一部分，进行革兰氏染色。平板划线分离操作法示意图5复发酵试验上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒置管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者，即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。每组：三倍浓缩乳糖蛋白胨（5ml）15管普通浓度乳糖蛋白胨（10ml）15管伊红美兰培养基150ml(5个平板)三角瓶1个（装27mL蒸馏水灭菌）、10ml吸管2支、1ml吸管2支包扎灭菌表2最可能数(MPN)表（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）思考题1.何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属？2.假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？3.为什么接种100、10mL水样，用的是3倍浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、0.1、0.01、0.001mL水样，则用乳糖蛋白胨培养基？