第三章++植物基因的克隆原理与技术

第三章植物基因的克隆原理与技术•内容•一．基因克隆所需要的酶和载体•二．植物转化载体的构建•三．基因克隆的方法基因克隆所需要的酶和载体一般认为基因工程诞生于1973年上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。1--DNA是遗传物质被证实1944年，AveryO.T.肺炎双球菌转化实验2--DNA双螺旋模型的提出Watson和Crick1953年，JamesWatson和FrancisCrick提出了DNA的双螺旋模型。3–“中心法则”的提出以Nireberg等为代表的一批科学家确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。1–工具酶的发现和应用Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。WernerArber1968年发现限制酶1–工具酶的发现和应用1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。2–反转录酶的发现和应用1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。3–载体的发现和应用1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组。3–载体的发现和应用1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。提取目的DNA酶切DNA片段导入到细菌中重组菌的筛选序列分析和基因表达等研究植物基因工程的基本流程载体基因克隆所需要的酶类•限制性内切核酸酶•DNA连接酶•DNA聚合酶•DNA修饰酶•核酸外切酶•单链DNA内切酶“”1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的命名和分类3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应限制性核酸内切酶限制性内切核酸酶的发现50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统；60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统；1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300种微生物中分离出了2300种，其中商品化的限制性核酸内切酶500余种。限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称。如：大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco；属名流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin；种名2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示如R.HinM.Eco3、用一个正体字母表示菌株的类型如EscherichiacoliRY13EcoR4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序如EcoRI、HindIII限制性内切核酸酶类型：目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶限制性核酸内切酶的分类不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析I型II型III型限制-修饰活性单一多功能的酶限制酶和修饰酶分开双功能酶内切酶的蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基活性辅助因子ATP、Mg2+、SAMATP、Mg2+、SAMMg2+甲基化位点寄主特异性的位点特异性切割否是否基因克隆中的用途用途有限十分广泛用途有限II型限制性核酸内切酶的3大特点识别位点的特异性识别序列的对称性切割位点的规范性与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端(cohesiveends)：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。5’端凸出（如EcoRI）3’端凸出（如PstI）平末端(Bluntend)：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同裂酶(isoschizomers)：能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。完全同裂酶识别位点和切点完全相同如HindⅢ和HsuI不完全同裂酶识别位点相同但切点不同如XmaI和SmaIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。BamHIGGATCCCCTAGG5’--3’3’--5’BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII影响酶活性的因素很多：DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素纯度的鉴定：紫外吸光值A260/A280浓度低于500ng/L酶切消化的缓冲液Mg2+Tris-HCLBSA（牛血清蛋白）酶切反应的温度（通常为37℃）影响酶切消化的其他因素时间体积RNA限制性核酸内切酶的消化反应酶切反应的基本步骤Buffer(10×)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L1.0kb0.4kb0.5kb0.6kb1.0kb＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMCKMTT1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略DNA连接酶及其应用DNA连接酶的发现T4DNA连接酶:由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。DNA连接酶:由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。DNA连接酶作用的特点A.连接的两条链必须分别具有3′端自由羟基（-OH）和5′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。DNA连接反应的条件4℃过夜加反应液转化CK-CK+重组菌影响连接效率的因素有：温度（最主要的因素）dNTP的浓度(10M-1M)连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶平末端DNA片段加接头连接法衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶Taq聚合酶逆转录酶DNA聚合酶及其应用DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较逆转录酶一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementaryDNA)。实际上，是一种RNA依赖的DNA聚合酶。来源RNA肿瘤病毒。最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）和鼠白血病毒反转录酶（avianmyeloblastosisvirus,M-MLV）AMV的性质由和两条多肽链组成。聚合酶活性和RNaseH活性。RNaseH：经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNADNARNaseHRNADNA逆转录酶的用途合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。mRNA5’AAAAAATTTTTT3’5’mRNA5’AAAAAATTTTTT3’5’DNA修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶T4多核苷酸激酶碱性磷酸酶细菌性碱性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase，BAP从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。SDS中加热68℃可完全失活。碱性磷酸酶的特性：催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。5’P--OH3’5’HO--P3’5’HO--OH3’5’HO--OH3’碱性磷酸酶HindⅢ酶切5’AAGCTTTTCGAA5’碱性磷酸酶A-OH5’P-AGCTTTTCGA-P5’HO-AA-OH5’HO-AGCTTTTCGA-OH5’HO-A易载体自连碱性磷酸酶的功能防止线性化的载体份子自我连接A-OH5’HO-AGCTTTTCGA-OH5’HO-A外源DNA5’P-AGCTTA-OH3’3’HO-ATTCGA-P5’连接酶A-AGCTTAAGCTTTTCGA-ATTCGAA转入细菌后会被修复基因工程载体基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌