LAMP技术及应用参考幻灯片

2020年5月20日星期三LAMP技术及应用湖北省疾控中心结防所周丽平1安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP技术环介导等温扩增法(loopmediatedisothermalamplification,LAMP),是一种在恒定温度下实现核酸的指数级扩增的技术已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫)LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分枝杆菌诊断鉴别中世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案2安徽省胸科医院&安徽省结防所县区级检测结核分枝杆菌环介导等温扩增多色巢氏荧光PCR法交叉引物发RNA等温扩增法等省、自治区检测结核分枝杆菌检测是否对利福平和异烟肼耐药地市级结核分枝杆菌及是否对利福平和异烟肼耐药基因芯片溶解曲线线性探针“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术3安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP技术的原理对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。4安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法使用的酶链置换型DNA聚合酶:BstDNAPolymerase扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。2020年5月20日星期三5安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法的引物设计2020年5月20日星期三6安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法的原理2020年5月20日星期三7安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法的原理2020年5月20日星期三8安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP技术特点灵敏度高LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。特异性强通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。速度快恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省却温度循环，在30min～60min内即可完成反应过程。设备简单只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。产物检测便捷在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性判断LAMP反应；可与荧光物质结合。9安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法和其他PCR法的比较2020年5月20日星期三10安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法和其他PCR法的比较2020年5月20日星期三11安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法所需的试剂2020年5月20日星期三12安徽省胸科医院&安徽省结防所2020年5月20日星期三LAMP技术简介环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。13安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法常规操作步骤2020年5月20日星期三14安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法的检测方法琼脂糖凝胶电泳法由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。（图A）肉眼观察法在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）通过荧光染料检测有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBRGreenI等进行染色，来检测扩增是否发生。（图C）2020年5月20日星期三15安徽省胸科医院&安徽省结防所2020年5月20日星期三16安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法在结核菌检测中的应用2020年5月20日星期三靶标限定:结核分枝杆菌复合群gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本，长远来说，更有利于避免耐药性的产生。17安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法在结核菌检测中的应用2020年5月20日星期三适宜的检测对象以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测对象，可避免假阳性过高。反应管预装反应体系扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶污染；用户操作简便、减少操作误差。结果易读产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。技术特点：18安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法在结核菌检测中的应用2020年5月20日星期三临床试验——LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果灵敏度＝89.54%阳性结果预期值＝98.13%特异性＝98.93%阴性结果预期值＝93.77%总符合率＝95.31%19安徽省胸科医院&安徽省结防所LAMP法在结核菌检测中的应用2020年5月20日星期三临床试验——LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果阳性一致率=88.56%阴性一致率=93.06%总符合率=91.36%20安徽省胸科医院&安徽省结防所WHO认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。2020年5月20日星期三21安徽省胸科医院&安徽省结防所2020年5月20日星期三LAMP法在结核菌检测中的应用现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较22安徽省胸科医院&安徽省结防所痰标本目测法检测流程100分钟23一、样品处理1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中24一、样品处理2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清25一、样品处理3、沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤26一、样品处理4、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清5、重复步骤3、4一次27一、样品处理6、向含沉淀物的离心管分别加入100μLDNA提取液，混匀后沸水浴10min28一、样品处理7、冷却至室温后，13000r/min离心﹥5min，上清即为核酸模板29二、核酸扩增1、向反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2.5μL，注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反应管大腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区30二、核酸扩增2、置65℃恒温反应60min31三、结果判断1、反应结束，将反应管倒置甩动2次，再正置甩动2次，使工作液与显色液充分混合32三、结果判断2、在阴性对照反应管液体颜色为无色（或橙色），阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下：•若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性；•若待检样本反应管中液体颜色为无色（或橙色），则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性；•若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。33（1）LAMP结果为阳性，涂片结果也为阳性。可做出患者疑似患有结核病的诊断，并开始抗结核治疗，同时等待培养结果。（2）LAMP结果阳性，而涂片结果为阴性。根据临床症状判断是否开始抗结核治疗，同时等待培养结果。这时可考虑增加一个或一个以上的标本进行LAMP检测以确认。如果增加的标本检测结果也为阳性，则患者可被初步诊断为患有结核病，并等待培养的结果。（3）LAMP结果为阴性，涂片结果为阳性。应考虑LAMP结果是否受痰标本中的抑制物影响，并增加一个或一个以上的标本检测。若增加的标本检测结果仍不变，且排除抑制物因素，则患者可初步考虑为非结核分枝杆菌感染，进行进一步确诊实验。（4）LAMP结果为阴性，涂片结果亦为阴性。根据临床症状判断是否开始抗结核治疗，并等待培养结果。（5）随访患者LAMP结果阳性，不能作为随访患者的疗效评价。LAMP检测结果的临床应用342020年5月20日星期三一点建议•根据试剂盒不同、实验室严格分区–溶液配制区、样品处理区、检测区•基本操作–混匀、吸取–模板最后加入，按照先阴性、后阳性，从低到高梯度，最后阳性对照•环境污染–UV照射–DNAZAP等DNA降解试剂35安徽省胸科医院&安徽省结防所谢谢!2020年5月20日星期三36安徽省胸科医院&安徽省结防所