质粒DNA的双酶切

一、实验目的•通过本实验让学生掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法二、实验原理•限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列•多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断，这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象•限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶•限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：•粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G’AA|TTC……3’3’……CTT|AA’G…...5’|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序。‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”•平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆影响限制性内切酶活性的因素：•DNA的纯度•DNA的甲基化程度•酶切消化反应的温度•DNA的分子结构•溶液中离子浓度及种类•缓冲液的pH值双酶切的两种酶介绍•XhoⅠ酶（TaKaRa公司）识别序列和切割位点：•EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）识别序列和切割位点：三、仪器、材料与试剂•水浴锅•移液枪和枪头•制冰机•浮板•R-pGEX-4T-1质粒DNA•XhoⅠ酶•EcoRⅠ酶•10×HBuffer•无菌水•小离心管四、实验步骤•质粒DNA的双酶切反应体系：反应条件：温度37℃，酶切1.5h•琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果•紫外线投射仪观察结果•UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）EcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL10×HBuffer2μL质粒DNA10μL～12μL≤1μg无菌水6μL～4μL总体积20μL（无菌水补至总体积）五、思考题•Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎样的末端？•影响限制性内切酶活性的因素有哪些？？