酶学发展与酶制剂应用

酶学发展与酶制剂应用罗扬炅，王超甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州（730070）E-mail：[e-mail]摘要：酶是由活细胞产生的具有催化能力的特殊有机物。酶工程是现代生物技术的重要组成部分。新陈代谢是生命活动的重要特征，一切生命的活动都是由代谢的正常运转来维持的，而生物体代谢过程中的各种化学反应都是在酶的作用下进行的。因此，研究酶的理化性质及其作用机理，对于阐明生命现象本质有重要意义。作为生物工程的重要组成部分，酶和酶工程不但受到生物化学工作者的重视，也日益被广大工农业，医药保健工作者重视。关键词：酶工程酶制剂酶学新陈代谢1．引言当前，生命科学处于大综合和大发展的时期，它适用领域广泛，将成为自然科学中发展前景昀广泛的科学，各学科间相互渗透，边缘学科蓬勃发展，酶工程是其中较突出者。酶鲜明的体现了生物识别、催化、调节等奇妙功能。酶的研究会深刻影响美工程乃至整个生命科学领域，而且还会刺激许多其他学科的研究。现在酶及其模拟体系已应用与有机合成工业、药物、化学品和精细化工产品的生产，在可再生资源、能源、环境保护等一些根本性重大问题上，也有引人入胜的前景。本文只就酶学及酶工程的发展，酶制剂的应用做一概述，希望让更多的人了解这一广泛的学科领域。2．酶学的产生当今，酶学已成为一门内容广泛，发展迅速的科学。它的分支遍及很多领域，并于许多学科紧密联系，特别是同生物化学、物理化学、微生物化学、遗传学、植物学、农学、药理学以及生物工程的关系更为密切，由于酶的独特的催化功能，今年来，它在工业、农业和医药等各个方面的应用也越来越广泛。2.1酶及酶学酶是由活细胞产生的具有催化能力的一类特殊的有机物，包括蛋白质和RNA，这些酶大部分位于细胞体内，部分分泌到细胞体内，参与新陈代谢过程。酶学简单的说就是研究酶的科学，是人们研究利用酶的组成、作用机理，制备及其利用的一门学科。2.2酶学研究简史要准确的说出酶是何时出现的是非常空难的事情，人们对酶的认识是起源与某些生产活动。我国在夏商时代酿酒已盛行，酒是酵母发酵的产物。约3000年前，利用麦曲含有淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖，制造了。[1]春秋战国时代，漆以被广泛利用，那时所用的漆是漆树的树脂被漆酶作用的氧化产物。公元10世纪左右，我国已能用豆类做酱。用曲霉治疗消化障碍也是我国人民昀早发现的，曲富含酶和维生素，至今仍是常用的健胃药。这些是我国人民在生活中经验的总结，并来形成理论。国外人们对酶的认识也与了解发酵和消化现象有关。1833年payen和person从麦芽糖的水抽提物中用酒精沉淀得到了一种对热不稳定的活性物质。这就是淀粉酶制剂。1878年-1-首先将上述物质称为酶。1896年德国学者buchner兄弟发现了一种能发酵的蛋白质成分—酒化酶。20世纪初，酶学得到了迅速的发展。1973年michaelidme酶促反应动力学原理——米氏学说。1926年，summer从刀豆中得到脲酶结晶。现已发现的生物体内存在近8000种酶。20世纪50~60年代koshlond提出了“诱导契合”理论，1982年RNA催化能力被发现，说明酶不一定是蛋白质。1986年sohulti和leatner两个小组同时获得了抗体酶。2.3酶工程简介酶工程是生物工程的重要组成部分，是随酶学研究的迅速发展，特别是酶的应用推广发展起来的一们新的技术科学，也是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术[2]。它是在一定的反应装置中利用酶的催化性质将相应原料转化为有用物质的技术。酶是生物体内进行新陈代谢不可或缺的生物催化剂，所以酶的开发利用是当代新技术革命的一个重要课题。酶工程主要指天然酶制剂在工业上的大规模的应用，由四个部分组成①酶的生产；②酶的分离纯化；③酶的固定化；④生物反应器[3]。2.4酶工程的研究意义酶是促进一切新陈代谢反应的物质，没有酶就没有生命。酶研究深刻影响生物化学以至整个生物学领域。20世纪以来。化学与生物学相互渗透，形成了生物化学、生物有机化学等。这些学科的发展将为自然科学的发展提供巨大的推动力。生物技术以在工业、农业、医药、食品等方面得到了广泛的利用，并在解决能源、资源、环境等方面问题上起着重要作用。作为生物工程的重要分支的酶工程将有巨大的发展潜力。3．酶的分类组成和作用机理3.1酶的分类1964年，国际生物化学联合会中的酶学委员会公布了酶的系统命名法及其分类报告。1972年、1978年和1984年又先后三次作了修改、补充。这一修改已得到了普遍同意。按酶的催化反应类型和作用的底物可将酶分成六大类：3.1.1氧化还原酶在体内参与产能，解毒和某些生理活性物质的合成。重要的有各种脱氢酶、氧化酶、过氧化酶等。3.1.2转移酶在体内转移化合物的基因，参与核酸蛋白质，糖及脂肪的代谢合成。重要的有酮醛基转移酶、酰基转移酶、磷酸基转移酶等。3.1.3水解酶在体内外起降解作用，也是人类应用昀广的酶类。重要的有各种脂肪酶、糖苷酶、肽酶等。3.1.4裂合酶此类酶可脱去底物上某一基团而产生双键，或在双键处加入某一基团。它们分别可催化-2-—C，C—O，P—O等键。3.1.5异构酶此类酶可对分子进行异构化，而进行顺反异构、醛酮异构、分子内转移和裂解等。3.1.6合成酶这些酶与合成许多生命物质有关，其特点是需要能量，有的还需要金属离子作为辅助因子。可形成C—O，C—S，C—C等键。3.2酶的组成和结构特点虽然1982年RNA的催化能力被发现，但大多数酶都是蛋白质。因此酶必然具有四级结构：一级结构是具有一定氨基酸排列顺序的多肽链；二级结构是一级多肽链由氢键作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构是在二级结构基础上进一步盘曲而形成的包括主侧链的三维排列；低聚蛋白各折叠多肽链在空间专一性三维排列即为四级结构。低聚蛋白（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。酶蛋白有三种组成形式：①单体酶；②寡聚酶；③多酶复合体。仅有少部分酶是由单一蛋白质组成，大部分酶是复合蛋白，它是由蛋白质部分和非蛋白质部分组成。酶蛋白本身无活性，在辅助因子存在下才有活性。辅助因子可以是无机离子，也可以是有机物。在六类酶中，除水解酶和连接酶外，其它酶在反应时都需要特定的辅酶[4]。3.3酶的作用机理酶一般是通过其活性中心—氨基酸侧炼基团，先与底物形成一个中间复合物，随后再分解成产物，释放出酶。酶的活性部位是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远氨基酸残基形成的三维实体。酶活性部位的活性残基与底物分子结合，首先将它转录为过渡态，然后生成产物。目前有两种模型解释酶如何与它的底物结合：①锁和钥匙模型：EmilFisher提出底物形状和酶活性部位像钥匙插入锁中，当正确组合在一起时，正好相互补充。②诱导契合模型：1958年DanielEKoshlandJr.提出底物的结合在酶的活性部位诱导出够象变化。这就是诱导契合学说。4.酶作为催化剂的特点。和其他催化剂比较，酶具有以下三方面的显著特点：①高催化效率；②高专一性；③酶活性受一些化合物调控。4.1催化能力酶加快反应的速度达1014倍。4.2专一性大多数酶对所作用的底物和催化的反应都具有高度的专一性，不同的酶专一性不同。4.3调节性生命现象表现了它内部反应历程的有序性。这种有序性是受多方面的因素调节和控制-3-的，而酶活性的控制又是代谢调节作用的主要方式。酶活性的调节控制主要有以下七种方式：①酶浓度调节；②共价修饰调节；③限制性蛋白水解作用与酶活性调节；④抑制剂的调节⑤反馈调节；⑥金属离子和其他小分子化合物的调节[5]；⑦激素调节。5．酶的产生，分离与纯化5.1酶的产生植物细胞培养产酶，是20世纪80年代发展起来的新技术。首先，选择适宜的植物外植体，经诱导，选育得到优良的植物细胞，再在人为控制条件下，从生物反应器中培养出能产色素，香精和药物等次级代谢产物的植物细胞。郭勇等人先后进行了植物细胞培养生成次级代谢物的研究，选育出了优良的木瓜细胞，大蒜细胞，胡萝卜细胞等，分别用于生产木瓜蛋白酶，过氧化氢酶等酶及色素，药物等次级代谢产物[6]。5.2酶的提取5.2.1生物组织的破坏各种生物组织的细胞特点不同，在破碎时，要根据细胞的性质和量选择合适的方法。5.2.1.1机械法利用机械力的搅拌，剪切，研碎细胞。5.2.1.2超声波法经超声波一定时间处理，细菌和酵母细胞都能得到很好的破碎。5.2.1.3冻融法生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。5.2.1.4渗透压法细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。5.2.1.5酶消化法利用溶菌酶，蛋白水解酶，糖苷酶对细胞壁和细胞膜的酶解作用，使细胞崩解破碎。5.2.2抽提破碎组织一般在适当的缓冲液中进行。典型的抽提由以下几部分组成：抽提液=离子强度调节剂+PH缓冲剂+温度效应剂+蛋白酶抑制剂+防氧化剂+重金属络合剂+增溶剂。一般，抽提生物膜中的酶需加去垢剂等增溶剂，促使酶抽提，昀后用透析法去除增溶剂，恢复酶活性。5.3酶的提纯一般都依据酶的大小，形状，电荷物质，溶解度，专一结合位点等性质而建立的。5.3.1调整溶解度的方法5.3.1.1改变离子强度当向溶液中加入盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，溶解度增加，称为盐溶。当盐浓度继续增大时，盐离子使水浓度相对降低，蛋白质相互凝聚而沉淀出来。大部分酶呈溶解蛋白的形式存在于细胞中，因此，使用此方法可以使酶沉淀析出。-4-或温度酶在等电点时溶解度昀小，将溶液PH调节到等电点，可使酶析出。5.3.2根据酶分子大小，形状不同的方法5.3.2.1离心分离离心分离有一般离心与差速和密度梯度离心分离两种：①一般离心分离：匀浆处理后，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行分离纯化。②差速和密度梯度离心分离：对某一悬浮液选用一较低的转速进行离心，分离出上清液，然后对上清液选用较高的转速离心，又得到沉淀和上清液，重复操作，以达到分级分离样品的技术。5.3.2.2凝胶过滤法凝胶过滤法分离酶时，大的酶分子被凝胶颗粒排斥，因而在颗粒外移动，速度较快；小分子酶则进入凝胶颗粒的小孔，路径长，移动慢，从而将酶蛋白分离。5.3.3根据酶分子电荷性质的方法5.3.3.1离子交换柱层析离子交换柱层析是根据被分离的物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物理分离的。5.3.3.2层析聚焦法此方法分离蛋白质分子的过程与等电聚焦电泳极其相似，区别仅在于其连续稳定的PH梯度是在固相的离子交换载体上形成的。5.3.3.3等电聚焦电泳每种蛋白质都有其特定的等电点，如果某一处的PH等于某一蛋白质的等电点，蛋白质将不再移动。等电聚焦用的缓冲液由一系列带不同电荷性质的聚氨基酸组成。当电泳开始时，聚氨基酸因为泳动快而在电场中先形成一梯度。蛋白质分子则在这一PH梯度内迁移，直到与其等电点相同的位置。经过分别洗脱，就可以得到纯化的样品。5.3.4根据酶分子专一性结合的方法。5.3.4.1亲和层析该法是利用酶分子独有的专一性结合位点或结构的性质分离蛋白质。5.3.4.2免疫吸附层析利用抗原抗体反应的高度专一性分离纯化蛋白质。5.3.4.3共价层析利用层析介质与被分离物间形成共价键的方式来进行分离。6.酶工程应用酶工程是现代生物技术的重要组成部分，它作为一项高新技术将对各种工业的发展起重要推动作用。6.1酶工程技术在医疗中的应用由于外源性酶在体内易产生免疫反应，且稳定性差，因此固定化酶，人工细胞，脂质体及红细胞膜包埋酶工程技术在临床治疗中应用日趋活跃。从植物中克隆苯丙氨酸脱氢酶基因，导入肠道有益菌乳酸球菌中表达，用以治疗引起儿童智力障碍的症，已在动物实验中获得成功[7