细胞冻存与复苏

暨南大学医学院生物化学教研室费嘉细胞复苏与冻存一、细胞冻存•在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内、外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，引起细胞死亡。•在培养液中加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。•目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）。•DMSO的常用浓度为5%-10%。•添加DMSO保护剂的细胞在液氮中冻存1-2年，存活率可达80%-90%。•DMSO液需预先用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。试剂和器材•器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶，2ml）、离心管、吸管、离心机等试剂：含保护剂的培养基（即冻存液）•操作步骤：1、消化细胞，收集细胞悬液。2、离心，1000rpm10min，弃上清液。3、沉淀加冻存液，计数，调整至5×106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。5、封口6、标注标明细胞种类、冻存日期。7、梯度降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮•注：本室降温程序：室温→4℃30分钟→冰水中10分钟→－20℃30分钟→－80℃过夜→液氮注意事项：•1、冻存细胞的活力95%以上•2、避免冻伤•3、避免液氮挥发干净•4、新复苏的细胞在72小时里最好不要更换培养基，或传代。•5、新引进的细胞株，应首先做好冻存备用。二、细胞复苏•复苏原则：速融-----冻存细胞的复苏以急速融化为原则，使培养物能快速通过对细胞有损害的-5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。操作步骤:一、准备工作•1、37℃水浴•2、准备一个内装5-10ml细胞完全培养基离心管，温度=25℃。二、复苏1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃水浴中，1分钟。2、打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀。3、1000rpm离心10min，弃去上清液。4、沉淀中加入适当培养基，37℃常规培养，第二天观察生长情况。细胞复苏注意事项•防止冻存管在水浴中融化时爆炸----远离----勿拆除包装布袋，佩戴防护眼镜、口罩。•快速融化，并迅速去除冻存液。五、细胞运输•1.长距离运输（几天）•2.短距离运输（几小时）•3.细胞悬液空运•4.液氮冻存运输四、血清灭活•目的：去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。•方法：56℃30min注意事项：血清溶解过程中必须规则地摇晃均匀，才不会使产品质量受损。步骤：-20℃2-8℃部分溶解室温下全部溶解56℃水浴热灭活30min