第一章 色谱发展史

《色谱分离技术》教案教学重点：色谱分类及基本术语。注意事项：第一章绪论第一节色谱发展史1.1.1色谱方法的问世俄国植物学家茨维特(Tswett)于1903年前后在波兰的华沙大学研究植物叶片的组成时，用白垩土(碳酸钙)作吸附剂，分离植物绿叶的石油醚萃取物得到黄色、绿色和灰黄色彼此分离的六个色带。其方法是：把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物绿叶的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙上，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上形成三种颜色的六个色带。茨维特把这样形成的色带叫做“色谱”(Chromatographie)，茨维特用此名于l906年在德国植物学杂志上发表。英译名为(Chromatography)，在这一方法中把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，纯净的石油醚叫做“流动相”。现在把茨维特开创的方法叫液—固色谱法(Liquid-SolidChromatography)。1.1.2色谱的发展简史在茨维特提出色谱概念后的二十多年无人关注这—“伟大的发明”。直到l931年德国的Kuhn和Lederer才重复了茨维特的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α、β、γ－胡萝卜素，此后用这种方法分离了六十多种这类色素。Martin和Synge在1940年提出液－液分配色谱法(Liquid-SolidPartionChromatography)，即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相为某种液体。1941年他们发表了用气体作流动相的可能性，十一年之后James和Matin发表了从理论到实践比较完整的气－液色谱方法(Gas-LiquidChromatography)，因此而获得了1952年诺贝尔化学奖。在此基础上l957年Golay叫开创了开管柱气相色谱法(Open—TubularColumnChromatography)，习惯上称为毛细管柱气相色谱法(CapillaryColumnChromatography)。1956年VanDeemter等在前人的基础上发展了描述色谱过程的速率理论。1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。另一方面，早在1944年Consden等就发展了纸色谱，1949年Macllean等在氧化铝中加人淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法(TLC)得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使得TLC得到广泛的应用。在上世纪60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱(HPLC)。80年代初毛细管超临界流体色谱(SFL)得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳(CZE)，在90年代得到广泛的发展相应用。同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期也受到重视。对于生物化学家来说，有时更爱使用色谱的别称“层析”，两者指的是同一技术。第二节色谱分析和色谱仪的定义及分类在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法或色谱分析也称之为色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当两相做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。可完成这种分离的仪器即色谱仪(Chromatograph)。色谱分析的分类可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。1.2.1按流动相和固定相的状态对色谱分析分类1．气相色谱（GC）又可分为气－固色谱和气－液色谱(GLC)，前者是以气体做流动相、以固体做固定相的色谱；后者是以气体为流动相．以液体为固定相的色谱（GSC）。2．液相色谱（LC）又可分为液—固色谱（LSC）和液—液色谱（LLC），前者是以液体做流动相，以固体做固定相的色谱；后者是以一种液体做流动相，以另一种液体做固定相的色谱。在液相色谱中如把固定相装在一个管子里(色谱柱)，液体流动相流过色谱柱中的固定相，这种形式的色谱叫柱色谱。由于固定相和流动相有多种多样，所以在液相色谱中又包含多种方法。3．纸色谱和薄层色谱如果是用滤纸或是涂在玻璃板(或铝箔)上的硅胶(或三氧化二铝等)做固定相，就叫纸色谱和薄层色谱，总称平面色谱。平面色谱是滤纸或硅胶层的毛细管作用把流动相(溶剂)从一端吸上来，使混合物得到分离。4．体积排阻色谱是以一定尺寸的多孔固体作固定相，以液体做流动相，按分子尺寸大小进行分离的方法，多用于高聚物分子量分布的测定。5．超临界流体色谱（SFC）是以超临界流体作流动相，以固体或液体作固定相的色谱。所谓超临界流体是指温度和压力在超临界温度和超临界压力之上的一种既不是气体也不是液体的流体。这种流体因其密度的不同具有不同的溶解各种物质的能力。因而它更类似于液相色谱。6．电色谱这类色谱有多种模式，有用电压(电渗流)驱动的毛细管电泳，而毛细管电泳又可分为五种模式(毛细管区带电泳，毛细管凝胶电泳，毛细管波束电动色谱，毛细管等电聚焦，毛细管等速电泳)。还有用电压和泵同时驱动的电色谱。7．激光色谱是—种用不同功率及波长激光作动力使粒径不同的粒子进行分离的方法，是最近才出现的新技术。凡要完成上述的色谱过程，均使用了不同类型的色谱仪：气相色谱仪，液相色谱仪，薄层色谱扫描仪，体积排阻色谱仪(凝胶渗透色谱仪)，超临界流体色谱仪，另外，液相色谱仪中还有专用的离子色谱仪和氨基酸分析仪等。1.2.2按应用领域不同对色谱仪分类1．分析用色谱仪又可分为实验室用色谱仪和便携式色谱仪。这类色谱仪主要用于各种样品的分析，其特点是色谱柱较细，分析的样品量少。2．制备用色谱仪又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备、蛋白质的纯化。3．流程色谱仪在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪。目前主要是工业气相色谱仪，用于制药、石油精炼、石油化工及发酵工业中。1.2.3按分离机理分类1.利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。2.利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。3.利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。4.最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。1.2.4.按照展开程序分类按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。1．洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。2.顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。3.迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。第三节现代色谱分析的特点和应用领域最近20年是色谱发展最快的时期，特别是80年代到90年代，有许多崭新的色谱分析方法出现，如在气相色谱中的毛细管柱工艺的发展；毛细管超临界流体色谱和超临界流体萃取的兴起；毛细管电泳的问世；电色谱等加入色谱的行列；光色谱和场流分离为生物大分子的分离提供了新的途径等等。21世纪将是生命科学、材料科学、信息科学的时代，而环境科学又是人们面临的重大课题，色谱分析新方法的出现和发展正是服务于这些重要科学领域的新技术。生物大分子的分离和纯化，推动了毛细管电泳和全新的高效液相色谱的发展；为了解决药物对映异构体的拆分，发展了各种各样的手性分离介质；为了极微量环境污染物的检测，发展了各种色谱高灵敏检测器；为了适应石油化工的需要，出现了各种高温毛细管气相色谱分析方法；为了能高选择性处分离生化分子，发展了选择性极强的亲和色谱柱和方法。另一方面，为了弥补色谱分析定性功能较差的弱点，大力发展了色谱和其他仪器的联用技术，特别是液相色谱和毛细管电泳与质谱的联用技术近年已趋于成熟，它将对生物大分子的分离和鉴定发挥极大的作用。第四节色谱流出曲线及有关术语（一）色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。（二）基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。色谱流出曲线色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）（四）保留值1.死时间t0不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即ū=L/t02.保留时间tr试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间。3.调整保留时间tr´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tr´=tr-t0。由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。4.死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速con（cm3·min-1）计算。V0=cotn0式中con为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。它仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。5.保留体积Vr指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：Vr=trcon6.调整保留体积Vr¢某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。Vr′=Vr-V0=tr′con7.相对保留值r2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tr2‘/tr1´=Vr2’/Vr1‘由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号α表示，即α=tr´(i)/tr´(s)式中tr´(i)为后出峰的调整保留时间，所以α总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。(五)区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱