抗菌肽抑制脂多糖诱导的炎症反应

动物营养学报２０１６，２８（１２）：３７７０⁃３７７６ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１６．１２．００８抗菌肽抑制脂多糖诱导的炎症反应杨颜铱　陈　芸　高　爽　刘　旗　陈　憧　姚淑华　邓俊良∗（四川农业大学动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，成都６１１１３０）摘　要：抗菌肽是一种对多重耐药菌株表现出特异性抗菌机制的小分子多肽。同时，抗菌肽还具有抗炎活性，可以通过直接中和脂多糖（ＬＰＳ）、抑制生物性炎症因子的产生来减轻炎症反应；亦可通过趋化白细胞、促进免疫细胞增殖等来影响获得性免疫，从而调节宿主免疫系统发挥保护作用。本文综述了近年来ＬＰＳ诱导炎症产生的机制及抗菌肽抑制ＬＰＳ诱导炎症反应的作用机理。关键词：抗菌肽；脂多糖；炎症因子；抑制炎症机理中图分类号：Ｓ８１１　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１６）１２⁃３７７０⁃０７收稿日期：２０１６－０６－２１基金项目：教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队项目（ＩＲＴＯ８４８）；四川农业大学双支计划（０３５７１５３７）作者简介：杨颜铱（１９９１—），女，四川南充人，硕士研究生，从事反刍动物疾病研究。Ｅ⁃ｍａｉｌ：[e-mail]∗通信作者：邓俊良，教授，博士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：[e-mail]　　脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）也被称为内毒素，是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，被认为是与革兰氏阴性菌感染相关的内毒素休克发病机制中的一个关键分子［１］，多在细胞分裂、死亡或抗生素治疗细菌感染的过程中释放出［２］。ＬＰＳ对细菌生存而言必不可少，它通过建立一个有效的渗透性屏障来阻止各种抗菌化合物入侵，包括疏水性抗生素、抗菌肽等［３］。抗菌肽是一种具有生物活性的带正电荷及具备疏水性和两亲性的小分子多肽。研究证实天然的阳离子抗菌肽可以防止细菌、病毒和寄生虫等多种感染［４－５］，还能直接中和ＬＰＳ，抑制炎性细胞因子的过度产生和释放从而控制炎症反应，并通过免疫调节减少炎性损伤，在炎症过程中具有重要的作用［６－７］。近段时间以来，抗菌肽因其抗感染性能可作为治疗人类以及动植物疾病的替代药物而备受关注［８］。本文综述了近年来ＬＰＳ诱导炎症产生的机制及抗菌肽抑制ＬＰＳ诱导炎症反应的作用机理。１　ＬＰＳ诱导炎症反应１．１　ＬＰＳ的化学结构　　ＬＰＳ是革兰氏阴性杆菌细胞壁结构与功能的重要组成部分，由Ｏ－特异性多糖链、核心寡聚糖及类脂Ａ构成，是带有负电荷磷酸基团的疏水性长链脂肪酸（图１）［９］。其中类脂Ａ是ＬＰＳ结构中最保守的部分，在ＬＰＳ的生物活性中起主要调控作用［１０］。ＬＰＳ的核心寡聚糖和磷酸基团都带有负电荷，提示ＬＰＳ对阳性离子具有极高的亲和性［１］。１．２　ＬＰＳ诱导炎症反应的信号通路　　免疫细胞可识别病原体相关分子模式（ｐａｔｈｏ⁃ｇｅｎ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎｓ，ＰＡＭＰｓ），在炎症反应中起重要作用［１１］。感染时，ＰＡＭＰｓ之一的ＬＰＳ与免疫细胞表面最主要的受体之一———ＣＤ１４结合并通过脂多糖结合蛋白（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＢＰ）形成ＬＰＳ⁃ＬＢＰ⁃ＣＤ１４三联复合物作用于Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ⁃ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ４，ＴＬＲ４）从而启动跨膜信号转导，发挥致炎效应［１２］。ＬＢＰ是一种介导ＬＰＳ与靶细胞表面受体ＣＤ１４结合的关键载体蛋白。ＬＢＰ的Ｎ端是ＬＢＰ与ＬＰＳ１２期杨颜铱等：抗菌肽抑制脂多糖诱导的炎症反应的结合位点，尤其是富含疏水性氨基酸和碱性氨基酸的ＬＢＰ１０９～１３３位残基容易与ＬＰＳ结合；而Ｃ端则是其与ＣＤ１４的结合位点。Ｔｏｌｌ样受体（Ｔｏｌｌ⁃ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲ）是第１个被发现并明确特征的模式识别受体（ｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＲＲ），ＴＬＲ４已被确认为可识别ＬＰＳ的受体［１３］。　　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：多糖；Ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ：磷脂；Ｃｏｒｅ：核心寡聚糖；Ｏｕｔｅｒｃｏｒｅ：外核心寡聚糖；Ｉｎｎｅｒｃｏｒｅ：内核心寡聚糖；Ｏ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈａｉｎ：Ｏ－特异性多糖链；ＬｉｐｉｄＡ：类脂Ａ；Ｈｅｐ：Ｌ－甘油基－Ｄ－甘露庚糖Ｌ⁃ｇｌｙｃｅｒｏ⁃Ｄ⁃ｍａｎｎｏ⁃ｈｅｐｔｏｓｅ；Ｋｄｏ：２－酮基－３－脱氧辛酸２⁃ｋｅｔｏ⁃３⁃ｄｅｏｘｙｏｃｔｕｌｏｓｏｎｉｃａｃｉｄ；ＧｌｃＮ：氨基葡萄糖ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ；波浪线为脂肪酸Ｚｉｇ⁃ｚａｇｌｉｎｅｓｍｅａｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓ。图１　ＬＰＳ的化学结构Ｆｉｇ．１　ＣｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＬＰＳ［９］　　ＬＰＳ参与细胞介导的炎症反应时有２条不同的信号转导通路。第１条是髓样分化因子８８（ｍｙ⁃ｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８，ＭｙＤ８８）依赖途径，第２条是含有Ｔｏｌｌ／（白细胞介素－１）ＩＬ⁃１受体（ＴＩＲ）结构域诱导干扰素β（ＴＲＩＦ）依赖途径，两者都由ＬＰＳ和ＴＬＲ４的关联触发［１４］。盛金良等［１５］的试验结果表明，ＬＰＳ能够很快诱导ＴＬＲ４的表达水平升高，在ＬＰＳ作用２０ｍｉｎ后即达到较高水平，且在整个试验过程中保持较高水平。　　ＬＰＳ／ＴＬＲ４信号通道的激活受到多种信号蛋白或受体的调控（图２）［１６］。髓样分化蛋白－２（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ⁃２，ＭＤ⁃２）是一种特殊的外分泌蛋白，能帮助ＴＬＲ４识别ＬＰＳ。首先，ＭＤ⁃２与ＴＬＲ４在免疫细胞表面形成ＴＬＲ４⁃ＭＤ⁃２复合体，当ＬＰＳ进入血液循环时，ＬＢＰ作为载体蛋白将ＬＰＳ传递给ＣＤ１４，后者进一步凝集ＬＰＳ并将其呈递给ＴＬＲ４⁃ＭＤ⁃２复合体。最后，ＭＤ⁃２识别并与ＬＰＳ结合形成ＴＬＲ４⁃ＭＤ⁃２⁃ＬＰＳ三聚体，激活ＴＬＲ４跨膜信号通路。ＭｙＤ８８依赖信号通路的激活导致丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＭＡＰＫｓ）、抑制性κＢ激酶（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａ⁃Ｂｋｉｎａｓｅ，ＩＫＫ）和核转录因子－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ⁃κＢ，ＮＦ⁃κＢ）磷酸化，最终导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ⁃α）、白细胞介素－１β（ＩＬ⁃１β）、白细胞介素－６（ＩＬ⁃６）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）、环氧合酶－２（ＣＯＸ⁃２）等的表达［１７］。ＭＡＰＫｓ通路主要包括ｐ３８、ｃ⁃Ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ⁃ＪｕｎＮ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）和细胞外信号调节激酶（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ，ＥＲＫ）［１８］。许多研究表明，抑制ｐ３８、ＪＮＫ和ＥＲＫ３条通路的磷酸化可达到抗炎目的。ｐ３８的激活是促炎细胞因子表达的先决条件，抑制ｐ３８通路已被证实可在人体内毒素血症中发挥抗炎作用［１９］。２　抗菌肽免疫调节功能的分子机制　　当ＰＡＭＰｓ与ＰＲＲ相互作用时，免疫细胞分泌趋化因子及防御素α和ＬＬ⁃３７等抗菌肽［２０］。抗菌肽可通过诱导肥大细胞发生脱颗粒作用，释放组胺和前列腺素Ｄ２，引起血管舒张并导致血液中免疫细胞的释放，进而诱导巨噬细胞凋亡和淋巴细胞活化来调节宿主免疫力。此外，抗菌肽还可以增强成纤维细胞的趋化性，促进内皮细胞和淋巴细胞的增殖，加速伤口愈合。例如，人抗菌肽ＬＬ⁃１７７３　动　物　营　养　学　报２８卷３７可与甲酰肽受体１（ＦＰＲ１）相互作用使单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和Ｔ淋巴细胞趋化［２１］。研究表明经过活化的ＦＰＲ１和ＬＬ⁃３７不仅对白细胞有趋化作用，还能增强白细胞的黏附力、吞噬能力，促进氧中间产物的释放，增强对细菌的杀伤力，从而增强免疫力［２２］。　　ＬＰＳ：脂多糖ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＢＰ：脂多糖结合蛋白ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＤ⁃２：髓样分化蛋白－２ｍｙｅ⁃ｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ⁃２；ＴＬＲ：Ｔｏｌｌ样受体Ｔｏｌｌ⁃ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ：细胞浆；ＥＲＫ１／２：细胞外调节蛋白激酶ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ⁃ｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ；ＪＮＫ：ｃ⁃Ｊｕｎ氨基末端激酶ｃ⁃ＪｕｎＮ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ；ＭｙＤ８８：髓样分化因子８８ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ⁃ｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８；ＩＲＡＫ：白细胞介素－１受体相关激酶ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ⁃１ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｋｉｎａｓｅ；ＴＲＡＦ６：肿瘤坏死相关因子６ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ６；ＳＲＥ：血清反应组件ｓｅｒｕｍｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ；ＡＰ⁃１：激活子蛋白－１ａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ⁃１；ＮＦ⁃κＢ：核转录因子－κＢｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ⁃κＢ；ＣＲＥ；ｃＡＭＰ反应组件ｃＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ；ＴＮＦ⁃α：肿瘤坏死因子－αｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ⁃α；ＩＬ⁃６：白细胞介素－６ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ⁃６；ＩＬ⁃８：白细胞介素－８ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ⁃８。图２　ＬＰＳ的信号转导途径Ｆｉｇ．２　ＳｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｏｆＬＰＳ［１６］３　抗菌肽与ＬＰＳ相互作用时结构与活性的关系　　针对抗菌肽的结构与活性关系的详细研究表明，有许多抗菌肽都具备中和ＬＰＳ的活性，但是不同结构的肽中和ＬＰＳ的活性存在着显著的差异。Ｈｅｉｎｂｏｃｋｅｌ等［２３］研究了Ｈｂγ⁃３５和Ｐｅｐ１９⁃２．５２种抗菌肽对ＬＰＳ聚合构造的影响。Ｈｂγ⁃３５作用时ＬＰＳ被分解为立方体结构，且Ｈｂγ⁃３５增加了ＬＰＳ诱导的人体单核细胞分泌ＴＮＦ⁃α。与之相反的是，Ｐｅｐ１９⁃２．５使ＬＰＳ从立方体结构转变成多层结构，从而抑制了ＴＮＦ⁃α分泌。　　Ｋａｃｏｎｉｓ等［２４］研究了一系列合成肽对ＬＰＳ的中和作用，表明ＬＰＳ形成多层结构的能力与抑制ＬＰＳ刺激产生细胞因子直接相关，且合成肽与ＬＰＳ的结合在抗菌肽的抗菌活性和抗炎活性均起着重要的作用。ｒＢＰＩ２１是中性粒细胞Ｎ末端的杀菌／通透性增加蛋白（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ⁃ｉｎｃｒｅａｓ⁃ｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＰＩ）片段，它能够选择性的抑制革兰氏阴性菌，且对ＬＰＳ有很强的亲和力。ｒＢＰＩ２１在与ＬＰＳ相互作用时可引起含有丰富的磷脂酰胆碱的革兰阴性细菌膜泄漏［２５］。　　事实上，许多在结构上不够优化的天然抗菌肽，可以通过适当地进行氨基酸取代改善其活性［２６］。例如Ｎａｎ等［２７］将抗菌肽ＬＬ⁃３７的类似物ａ４中５、１５位的苯丙氨酸替换为色氨酸后显著提高了它中和ＬＰＳ的活性。　　Ｓｉｎｇｈ等［２８］通过一系列来源于Ｓ１肽酶的抗菌肽来探究静电作用在抗菌肽与ＬＰＳ相互作用时发挥的作用，证实在很大程度上抗菌肽与磷脂膜结２７７３１２期杨颜铱等：抗菌肽抑制脂多糖诱导的炎症反应合是依赖于肽的两亲性构象，而与ＬＰＳ结合则取决于抗菌肽的净电荷及疏水性。同样，Ａｎｄｒä等［２９］报道ＬＰＳ与抗菌肽ＮＫ⁃２结合时不仅依靠静电作用，疏水作用也非常关键。Ｌｅｅ等［３０］根据牛源抗菌肽ＢＡＭＰ⁃２７合成了一种含１８个氨基酸残基的肽，ＢＡＭＰ⁃１８以及其类似物（ＢＡＭＰ⁃１８⁃Ｗ、ＢＡＭＰ⁃１８⁃Ｌ、ＢＡＭＰ⁃１８⁃Ｉ和ＢＡＭＰ⁃１８⁃Ｆ）。结果证实ＢＡＭＰ⁃１８及类似物能明显抑制ＴＮＦ⁃α和一氧化氮（ＮＯ）。尽管ＢＭＡＰ⁃１８⁃Ｗ疏水性低于ＢＭＡＰ⁃１８⁃Ｌ，其中和ＬＰＳ的能力却更强。说明抗菌肽中和ＬＰＳ的活性不仅与携带的正电荷数及疏水性有关，还存在其他的影响因素。４　抗菌肽直接中和ＬＰＳ的作用机制　　抗菌肽