分子生物学技术-课件

分子生物学常用实验技术ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology生物化学与分子生物学教研室徐文弟2010.9.23现代分子生物学•遗传中心法则与组学遗传信息传递的基本规律•分子生物学研究内容生物大分子结构与功能生物大分子的相互作用•分子生物研究技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质-核酸相互作用工具酶的应用遗传中心法则基因信息的流向、基因表达的环节与调控的不同水平；DNA所占的中心位置；RNA是信息表达的体现；蛋白质执行生物学功能。基因工程的基本原理!生命的起源？基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系基因组学是基础、转录组学是信息、蛋白质组学是功能、代谢组学是结果。整合也是创新•方法的结合•形态与机能研究的结合•中西医的结合21世纪分子医学发展的主要领域•分子诊断•基因治疗•生物工程药物第一讲蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析Isolation,Purification,IdentificationandStructuralAnalysisofProteins一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:是常用的蛋白质沉淀方法使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。•盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。•免疫沉淀法（immunoprecipitation）二、透析及超滤法:可清除蛋白质溶液中的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。•超滤法•透析(dialysis)三、电泳:是蛋白质分离与鉴定的常用方法电泳(elctrophoresis)蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。•几种重要的蛋白质电泳：蛋白质的二维电泳二维电泳图四、应用相分配或亲和原理：可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。•层析(chromatography)离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gelfiltration)：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。•蛋白质分离常用的层析方法五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：可进行超速离心分离•超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。•沉降系数(sedimentationcoefficient,S)蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。──────────────────────蛋白质分子量S──────────────────────细胞色素C(牛心)133701.17肌红蛋白（马心）169002.04糜蛋白酶原（牛胰）232402.54β-乳球蛋白（羊奶）371002.90血红蛋白（人）645004.50清白蛋白（人）685004.60过氧化氢酶（马肝）24750011.30脲酶（刀豆）48270018.60纤维蛋白原3397007.60蛋白质的分子量和沉降系数六、用化学或反向遗传学方法：可分析或演绎多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法•一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。化学法溶解法二硝基氟苯法（DNP法）肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法亮氨酸氨肽酶法细胞外氨肽酶法羧肽酶A法羧肽酶B法羧肽酶C法氨基酸和肽的末端测定法•通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个成分；而-折叠的CD谱不很固定。（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例X射线衍射法(X-raydiffraction)核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。（二）X射线衍射法和核磁共振技术：用于三维空间结构分析1A2.StructureofdCTP3.BaseTautomerism3.Chargaffrules-A=T,G=Chelical10layerLinesBetweenCrossPatterns(10ResiduesPerturn)EvidencefortheDoubleHelix1.FiberDiffractiondata:-Helicalgeometry-3.4Aºspacing(1Aº=10-10m)-34Aºpitch*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（三）根据氨基酸序列：预测蛋白质三维空间结构*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。30第二讲DNA操作的基本技术TheBasicTechnologiesforDNAManipulations31核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization32什么是核酸分子杂交•核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization）–以DNA的变性、复性为理论基础–指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程–可用于基因诊断核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。是基因诊断的常用技术探针技术基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。基因诊断的概念、特点及临床意义定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽(分子诊断）。诊断依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平变化。如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化。如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性基因诊断中常用的分子生物学技术•核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）•聚合酶链式反应(PCR)•单链构象多态性（SSCP）•限制性片段长度多态性（RFLP）•DNA序列测定（DNAsequencing）•生物芯片（biochips）•Western免疫印迹（Westernblotting）•免疫组织化学诊断基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物SSCP操作简便、检出率不高选择合适的片段RFLP结果可靠但限制较多选择合适的限制酶DNA测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片印迹技术44一、Southern印迹:可用于分析基因拷贝数的变化•由E.M.Southern在1975年提出•可用于分析基因拷贝数的变化•基本操作过程包括–待测DNA样品的制备和基因探针的标记；–待测DNA样品的电泳分离；–电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；–特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。EdwinSouthernSirEdwinSouthern(born1938),USbiologistanddeviseroftheDNAanalyticaltechniqueSouthernblotting.ThistechniqueusesenzymestofragmentDNA(deoxyribonucleicacid),andthefragmentsarethenseparatedinanelectrophoresisgel.Theseparatedfragmentsarethenblottedontoanitrocellulosefilterandmarkedwithradioactiveprobes.Theprobesindicatethepresenceofspecificgenes(lengthsofDNAthatcodeforproteins).Asheetofphotographicfilmisthenlaidoverthefilter.Theradioactivitydarkensthefilm,whichrevealsthepositionofgenesintheDNA.Thistechniqueiswidelyusedingeneticresearch.Photographedinthe1980s.核酸分子杂交流程待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针47Southern印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳转移杂交，显影酶切DNA样品上样DNA印迹重物缓冲液Northern印迹RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。Northern印迹杂交(Northernblotting)50二、Northern印迹和RT-PCR:可用于分析基因转录水平的变化•Northernblot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析m