2.蛋白质样品制备技术

Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity第二章蛋白质样品的制备Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity样品制备的原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80℃。勿反复冻融已制备好的样品。通过超速离心清除所有的杂质。加入尿素后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity一、样品的类型1.整体样品是生物个体小的物种（如微生物），可以整体取样。2.组织样品有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。3.细胞样品包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞）和从组织中分离同类的细胞样品。4.可溶性样品是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。第一节样品破碎与分离蛋白质Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity二、组织与细胞破碎为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity（一）温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合起来应用。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity1.渗透裂解非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级应用对象：血细胞、组织培养细胞。操作步骤：将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶胀而释放出细胞内容物。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity2.冻融裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要求为止。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity3.裂解液裂解含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。应用对象：组织培养细胞操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行悬浮处理。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity4.酶裂解有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温和裂解。应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity二、剧烈的蛋白裂解常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方法可以使细胞完全破碎裂解。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity1.超声裂解法超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。应用对象：悬浮细胞操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity2.压力杯法在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。应用对象：微生物细胞，如细菌、霉菌、酵母细胞及含有细胞壁的细胞。操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷的压力杯中，施加压力，然后收集挤出液。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity3.研磨法用研钵或研杵研磨细胞应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity4.机械匀浆法使用匀浆器破碎细胞或组织应用对象：固体组织，如心脏、肝脏、肾脏组织和细胞悬液。操作步骤：先尽量将组织剪成块，然后加有蛋白酶抑制剂的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity5.玻璃珠匀浆法剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物应用对象：细胞悬液或微生物操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细胞（湿重）加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min，冰浴1min。重复上述步骤。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白酶抑制剂。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑴PMSF(苯甲基磺酰氟）是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。⑵AEBSF为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑶金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）乙二醇双四乙酸（EGTA）通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。⑷肽蛋白酶抑制剂亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatinA），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑸甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。⑹Benzamidine通常浓度为1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。⑺变性剂在低温条件下处理。①直接加入强变性剂8mol/L脲、10％TCA或2％SDS。②强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在pH超过9.0的时候失活。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity四、蛋白质沉淀步骤这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉淀的步骤可能会改变蛋白的二维电泳图谱。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑴硫酸铵沉淀（盐析）原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L,并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min，通过离心沉淀蛋白。然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干扰IEF,必须被清除。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑵TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提取液中，终浓度将高达10％-20％。蛋白质可于冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10％-20％的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉淀，以除去TCA。然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑶丙酮沉淀这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多杂质，如去污剂、脂类。于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20℃沉淀至少2h，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑷在丙酮中用TCA沉淀两者联合应用更加有效，通常用10％TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.01％β-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT）。至少在-20℃沉淀45min，通过离心沉淀蛋白，并用含0.01％β-巯基乙醇溶液或20mmol/LDTT的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity⑸用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀这对于杂质含量高的植物样品很有效。蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。Bioinformatics,2010-2011,ShanxiAgriculturalUniversity在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。第二节蛋白质裂解技术Bioinformat