医疗器械微生物检验

1医疗器械微生物限度检验2概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。微生物限度检查细菌、真菌菌落数控制菌3概述微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物特点：1、个体微小，一般0.1mm2、构造简单，有单细胞的，简单多细胞的，非细胞的3、进化地位低分类：原核类：二菌，四体（细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体）真核类：真菌，原生动物，显微藻类非细胞类：病毒，亚病毒45概述医疗用品的分类按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安全性要求分三类：a)Ⅰ类医疗用品：接触人体完整皮肤的医疗用品b)Ⅱ类医疗用品：接触人体未破损粘膜的医疗用品c)Ⅲ类医疗用品：进入人体无菌组织、器官和血液以及接触破损皮肤和粘膜的医疗用品6常用检测标准《中华人民共和国药典》2010年版二部附录XIJ“微生物限度检查法”GB15979-2002《一次性卫生用品卫生标准》附录BISO11737-1:2006Sterilizationofmedicaldevices–Microbiologicalmethods—Part1:Determinationofapopulationofmicroorganismsonproducts7项目《药典》2010GB15979-2002细菌定量：营养琼脂培养基2个平皿定量：营养琼脂培养基5个平皿真菌定量：玫瑰红钠琼脂培养基至少2个平皿72h酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基定量：沙氏琼脂培养基5个平皿7天定性：沙氏液体培养基7天大肠埃希菌胆盐乳糖培养基、MUG培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基/大肠菌群胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基、乳糖发酵培养基乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培养基沙门菌营养肉汤、四硫酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚蓝琼脂）培养基、三糖铁琼脂培养基/铜绿假单胞菌胆盐乳糖、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、氧化酶试验、绿脓菌素试验、SCDLP培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验42℃生长试验金黄色葡萄球菌亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基、血浆凝固酶试验SCDLP培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验梭菌庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基、过氧化氢酶试验/溶血性链球菌/葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆菌肽敏感试验白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念珠菌显色培养基、1%聚山黎脂80-玉米琼脂培养基、芽管试验/8实验条件无菌操作技术实验环境实验器材9无菌操作技术微生物学基础微生物实践基础无菌操作意识10实验环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域或隔离系统；定期按GB/T16292-16294：2010《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证；实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板打开放于实验台上，至实验结束收起，30℃~35℃培养48h，菌落平均数应小于1cfu/φ90mm。11实验器具仪器超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。用具试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密PH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、牛皮纸等。12实验准备实验环境保证实验试液培养基灭菌方法13实验环境保证环境清洁，表面消毒（75%(V/V)乙醇、新洁尔灭(1:1000)溶液或其他适宜消毒溶液）空气过滤系统，紫外灯或臭氧空气消毒仪14实验试液稀释剂1.0.9%氯化钠溶液2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液3.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中蛋白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测定。表面活性剂、中和剂或灭活剂鉴定用试剂1.靛基质试液2.1%二盐酸二甲基对苯二胺试液（氧化酶试液）3.三氯甲烷4.1mol/l盐酸试液15培养基标准菌株处理及增菌用培养基选择性培养基鉴别培养基16培养基培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。应按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6。酵母菌霉菌（6.0～6.5）。调节可用1NHCl或NaOH。培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。制成的培养基应透明，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。17灭菌方式湿热：115℃~121℃，15min~30min物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染菌。干热：160℃~170℃，2h适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。灭菌程序需要经过验证。18计数培养基适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。19计数培养基适用性检查菌种•大肠埃希菌［CMCC（B）44102］•金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］•枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］•白色念珠菌[CMCC(F)98001]•黑曲霉[CMCC(F)98003]验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。20计数培养基适用性检查菌液制备取细菌新鲜培养物（一般18h~24h，白念24h~48h，黑曲霉5~7天），用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50cfu~100cfu的菌悬液（黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液）；菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2℃～8℃可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的贮存期内使用。21计数培养基适用性检查培养基接种金黄色葡萄球菌2个平皿营养琼脂培养基大肠埃希菌2个平皿枯草芽孢杆菌2个平皿玫瑰红钠琼脂培养基白色念珠菌2个平皿黑典霉2个平皿酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌2个平皿用相同的对照培养基替代被检培养基做对照22计数培养基适用性检查结果判定若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。23样品准备供试品进入无菌实验室前应作表面消毒，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。检验数量：应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。24样品准备检验量：除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；化学膜剂100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。25供试液制备液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品取10ml或10g用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌吐温80使供试品分散均匀;水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液；非水溶性供试品：乳化或萃取;膜剂供试品：取供试品100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml浸泡，振摇，作为1：10的供试液;肠溶及结肠溶制剂供试品：取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液;气雾剂、喷雾剂供试品，经处理后同第一项制备供试液;贴剂供试品具抑菌活性的供试品：培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法;26细菌、霉菌及酵母菌计数实验方法倾注平皿法薄膜过滤法培养基细菌总数：营养琼脂培养基霉菌及酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基27细菌、霉菌及酵母菌计数培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，逐日点计菌落数霉菌、酵母菌培养5天，逐日点计菌落数必要时可延长至7天进行菌落计数点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数28细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证（1）试验组平皿法：供试液1ml+1ml试验菌菌悬液，平行制备2个平皿，菌落计数；薄膜过滤法：供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入1ml试验菌，过滤，菌落计数；（2）菌液组测定所加的试验菌数；（3）供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数；（4）稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。稀释剂+试验菌菌悬液；29细菌、霉菌及酵母菌计数验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%；若试验组的菌数回收率均不低于70%，可照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。30细菌、霉菌及酵母菌计数1.平皿法采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。31细菌、霉菌及酵母菌计数营养琼脂-细菌玫瑰红钠琼脂培养基-霉菌32细菌、霉菌及酵母菌计数1.平皿法菌数报告规则：细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300、霉菌宜选取平均菌落数小于100的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据；以最高平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数；如果各稀释级的平板均无菌落生长，或仅是最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。33细菌、霉菌及酵母菌计数2.薄膜过滤法取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。34细菌、霉菌及酵母菌计数2.薄膜过滤法菌数报告规则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。35细菌、霉菌及酵母菌计数在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。3637控制菌检查法验证菌种（菌液制备同前）大肠埃希菌［CMCC（B）44102］金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］乙型副伤寒