各种材料全基因组提取试剂盒TAKARA

研究用CodeNo.9765说明书TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0v201306Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存与运输1●实验前的准备1●操作方法2●实验例3●洗脱体积对DNA提取量和浓度的影响5●洗脱次数对DNA提取量的影响5●注意事项6●不同材料的DNA提取量6●实验材料最大起始量7●Q&A7●制品说明本试剂盒是用于提取血液、革兰氏阴性细菌、培养细胞及植物组织（植物幼嫩的叶、茎、根等）、动物组织（Blood/Gram-negativeBacteria/CulturedCells/PlantTissue/AnimalTissue）等基因组DNA的广谱型小量纯化试剂盒。试剂盒采用了独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA。本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，组织细胞裂解后，提取操作仅需20分钟便可完成。使用本试剂盒可从50～100μl的哺乳动物全血（含抗凝剂）、1～10μl的有核红细胞全血（含抗凝剂）、1.0～5.0E+09的革兰氏阴性细菌、1.0E+05～1.0E+07的培养细胞、2～25mg的动物组织、10~25mg深加工品或25～100mg幼嫩植物组织中纯化得到多至数十微克的高纯度基因组DNA，提取得到的基因组DNA可用于PCR反应、Southern杂交以及RAPD、AFLP、RFLP等多种分子生物学实验。●制品内容（50次量）本试剂盒分试剂PartI与PartII两部分。■PartI-20℃保存ProteinaseK（20mg/ml）1mlRNaseA（10mg/ml）0.5mlPartII室温（15-25℃）保存BufferGL*112mlBufferGB*112mlBufferWA*128mlBufferWB*224mlElutionBuffer14mlSpinColumns50支Collectiontubes50支1含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。*2首次使用前，请添加56ml的100%乙醇，混合均匀。【试剂盒之外所需准备试剂】◆无水乙醇◆灭菌水◆PBS溶液●保存与运输1.本试剂盒分两部分保存，PartI请保存在-20℃；PartII于室温下（15-25℃）保存。2.本试剂盒分两部分运输，PartI请在-20℃条件下运输；PartII于室温下（15-25℃）运输。●实验前的准备1.准备56℃水浴。2.BufferGL若出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。3.BufferWB在首次使用前，请添加56ml的100%乙醇，混合均匀。4.洗脱结合于DNA制备膜上的基因组DNA时，将ElutionBuffer或灭菌蒸馏水加热至65℃使用将会提高基因组DNA的洗脱效率。-1-●操作方法操作流程见图1，细胞或组织裂解后全套操作约需20分钟（如果组织需要裂解，则所需时间因组织不同而不同），分为组织或细胞裂解、DNA与膜结合、DNA纯化等步骤，详细说明如下：1.组织或细胞的裂解：使用不同的实验材料需采用不同的裂解步骤，具体说明如下：◆动、植物组织，深加工品的裂解：①取2～25mg的动物组织、深加工品或25～100mg植物组织（切勿使用超过最大起始量的组织），置于2mltube中，用剪刀尽可能地剪成碎块，对于一些质地坚硬的组织也可以进行液氮研磨。②加入180μl的BufferGL、20μl的ProteinaseK和10μl的RNaseA（10mg/ml），于56℃水浴温浴至组织完全裂解（2~3小时，难裂解的材料可以适当延长裂解时间甚至过夜裂解。植物材料可能残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先12,000rpm离心2分钟，去除杂质之后再进行后续操作）。注）温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。③向裂解液中加入200μlBufferGB和200μl100%乙醇，充分吸打混匀。◆全血的裂解：①有核红细胞全血取1～10μl（含抗凝剂）、无核红细胞全血取50～100μl（含抗凝剂）加入至2mlTube中，用PBS溶液或灭菌水补至200μl。②加入180μl的BufferGB、20μl的ProteinaseK和10μl的RNaseA（10mg/ml），充分吸打混匀，于56℃水浴温浴10分钟。③向裂解液中加入200μl100%乙醇，充分吸打混匀。◆悬浮培养的动物细胞的裂解①用1.5mlTube收集1.0E+05～1.0E+07的细胞悬浮液，5,000rpm离心5分钟，弃上清（细胞培养液）。②加入200μl的灭菌水或PBS溶液悬浮细胞。③加入180μl的BufferGB、20μl的ProteinaseK和10μl的RNaseA（10mg/ml），充分吸打混匀，于56℃水浴温浴10分钟。④向裂解液中加入200μl100%乙醇，充分吸打混匀。◆贴壁细胞的裂解：①弃尽培养液，向每10cm2的贴壁细胞中加入1mlPBS，用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞，转移至1.5mlTube中，5,000rpm离心5分钟，弃上清，加入200μl的灭菌蒸馏水或PBS溶液悬浮细胞。②加入180μlBufferGB、20μl的ProteinaseK和10μl的RNaseA（10mg/ml），收集细胞悬液，充分吸打混匀，于56℃水浴温浴10分钟。③向裂解液中加入200μl100%乙醇，充分吸打混匀。-2-图1.操作流程简图剪碎或液氮研磨加BufferGL、ProteinaseK和RNaseA56℃温浴裂解液向裂解液中加BufferGB和无水乙醇溶液移至SpinColumn中弃滤液BufferWABufferWB弃滤液SpinColumn移至1.5mlTube上加ElutionBuffer基因组DNA溶液实验材料清洗SpinColumn◆E.coli等革兰氏阴性菌的裂解：①用1.5mlTube收集1.0~5.0E+09的细胞，12,000rpm离心2分钟，弃上清（细胞培养液）。②加入180μl的BufferGL、20μl的ProteinaseK和10μl的RNaseA（10mg/ml），充分吸打混匀，于56℃水浴温浴10分钟。③加入200μl的BufferGB和200μl100%乙醇，充分吸打混匀。2.将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。3.将500μl的BufferWA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。4.将700μl的BufferWB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认BufferWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿SpinColumn管壁四周加入BufferWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。5.重复操作步骤4。6.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。7.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置5分钟。注）将灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。8.12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。9.基因组DNA定量。提取得到的基因组DNA可通过电泳或吸光度测定以定量。●实验例1.从动物组织中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒从10mg的小鼠肝脏组织中提取基因组DNA，最终纯化得到了约5μg的高纯度基因组DNA；处理了1.2cm小鼠尾尖组织，纯化得到了10μg的高纯度基因组DNA，其电泳结果见图2。M1M21%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：小鼠肝脏基因组DNA2：小鼠尾尖基因组DNA图2.从动物组织中提取的基因组DNA2.从植物材料中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒处理了100mg的菠菜、油菜、茼蒿、小白菜，分别纯化得到了约5μg、3μg、4μg、3.5μg的高纯度基因组DNA，其电泳结果见图3。1%Agarose凝胶电泳图M:λ-HindIIIdigest1：菠菜基因组DNA2：茼蒿基因组DNA3：油菜基因组DNA4：小白菜基因组DNA图3.从植物材料中提取的基因组DNA-3-M12343.从全血中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒从5μl的鱼全血（含EDTA抗凝剂）和50μl的小鼠全血（含EDTA抗凝剂）中提取基因组DNA，最终分别纯化得到了约12μg和1μg的高纯度基因组DNA，其电泳结果见图4。M1M21%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：鱼全血基因组DNA2：小鼠全血基因组DNA图4.从全血中提取的基因组DNA4.从革兰氏阴性菌E.coli中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒从2.0E+09的E.coliJM109培养细胞中提取基因组DNA，最终纯化得到了约10μg的高纯度基因组DNA，其电泳结果见图5。M11%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：从JM109中纯化的DNA图5.从JM109中提取的基因组DNA5.从鲤鱼鳍、鳃中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒从25mg鲤鱼鳃、鳍中提取基因组DNA，最终分别纯化得到了约5μg以上的高纯度基因组DNA，其电泳结果见图6。M121%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：鲤鱼鳃基因组DNA2：鲤鱼鳍基因组DNA图6.从鲤鱼鳃、鳍中提取基因组DNA6.从深加工品牛肉干中提取基因组DNA，并扩增GenBank:V00654.1基因的528bp片段的实验例使用本试剂盒从25mg牛肉干中提取基因组DNA，最终纯化得到了约2μg以上的DNA，并扩增了GenBank:V00654.1基因的528bp片段，其电泳结果见图7。M11M221%Agarose凝胶电泳M1：λ-HindIIIdigest1：从牛肉干中纯化的基因组DNAM2：DL2,000DNAMarker2：GenBank:V00654.1基因的528bp片段图7.从牛肉干中提取的基因组DNA及PCR扩增结果-4-7.从HL60细胞中提取基因组DNA，并扩增β-Globin基因的约17.5kb的实验例使用本试剂盒从2.0E+06的培养细胞HL60中提取基因组DNA，最终纯化得到了约10μg的高纯度基因组DNA。以此基因组DNA为模板，PCR扩增了β-Globin基因的约17.5kb的DNA片段，其电泳结果见图8。M1M2M1%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：HL60培养细胞基因组DNA2:β-Globin基因（约17.5kb）图8.从HL60细胞中提取的基因组DNA及PCR扩增结果●洗脱体积对DNA提取量和浓度的影响使用本试剂盒提取2.0E+06HL60细胞的基因组DNA，洗脱时分别使用10μl、50μl、100μl、200μlElutionBuffer洗脱2次，DNA收量如图9所示，增加洗脱液体积可以提高DNA收量，但是浓度会随之降低。图9.洗脱体积对DNA提取量和浓度的影响图9.洗脱体积对DNA提取量和浓度的影响●洗脱次数对DNA提取量的影响使用本试剂盒从10mg和25mg的小鼠肝脏中提取基因组DNA，最终分别用100μl和200μlElutionBuffer分三次进行洗脱，三次分别洗脱得到的DNA收量如图10所示。图10.洗脱次数对DNA提取量的影响-5-溶出体积与DNA收量、浓度的关系02468101210ul50ul100ul200ul溶出体积DNA收量0100200300400500浓度DNA收量DNA浓度0510