转基因植物的筛选与检测

转基因植物的筛选与检测转基因植物的筛选与检测•问题•1.进行转基因操作了，如何选出来已成功导入基因的细胞？•2.转化体里的外源基因是否成功的表达了呢？1一、筛选的方法与原理•通过特定基因在转化体内的表达，利用特定的试剂，选择出来转化细胞。•注：1.特定基因又称“抗性基因”2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因”23二、检测的方法与原理•利用特定基因在转化体内的表达，对其表达产物进行检测。•不同分子水平上检测方法：SouthernPCRNorthernqRT-PCRWestern4•报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。•必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中原本不存在；(3)其表达产物能进行定量测定。例如：Kan抗性基因、Gus基因、Bar基因5•Gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。•缺点：（1）染色不均匀（2）不能进行亚细胞定位（3）不能进行活体染色6•Southern印迹杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。•特点：可清除操作过程中的污染(如DNA分离及植物DNA分离过程中的交叉污染)，以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高。Southern杂交程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高。7•Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上,用特定的DNA探针来检测RNA。•特点：Northern杂交与Southern杂交相比,更接近于性状表现,更有现实意义,被广泛用于转基因植株的检测。但RNA提取条件严格,在材料内含量少,不适于大批量样品的检测。8•Western印迹是将蛋白质从SDS-PAGE胶中电泳转移至固相支持体上,然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。•特点：Western杂交灵敏度极高，可以测出粗蛋白提取物中小于50ng抗原，在较纯的制剂中，可测出1～5ng抗原。能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。9•PCR/qRT-PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。•特点：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。材料用量少，检测方便，可以在试管苗阶段，甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息，便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于大批量样品分析，又能检测目的基因的完整性，是早期检测的一种较好方法。10Southern杂交•1.提取DNA•2.电泳•3.变性•4.转膜•5.固定DNA•6.探针的标记•7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）印迹DNA膜转移11Southern杂交转膜仪把膜和胶片紧密结合，压！12转膜•注意：•此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。故而称为印迹（blotting）。•用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜（Nylon）、化学活化膜和滤纸等。双链DNA变性单链DNA转移固相支持物电泳槽、缓冲液、夹板13Western•1.制胶及上样•2.电泳•3.转膜•4.封闭•5.抗体孵育•6.曝光显影曝光显影后的条带14•总结：这些技术需要转膜、杂交，操作繁琐，费用高,可对转基因植株随机取样检测。•Southern杂交特异性强，确定转基因植株中基因的存在、整合及稳定性，是检测外源基因的最可靠的方法。•Western杂交灵敏度高，能检测出蛋白质表达量，最具有现实意义。15谢谢大家！