酒精发酵

酒精发酵一、实验目的1．了解淀粉水解酶、糖化酶和活性干酵母活化的方法；2．掌握双酶法糖化淀粉的方法；3．掌握酵母发酵糖化液制取酒精的方法；4．了解糖浓度和酒精含量的测定方法。5．通过实验让学生理解糖的无氧酵解途；二、实验原理1．在无氧的培养条件下，酵母菌(或细菌)利用葡萄糖发酵生成酒精和二氧化碳，此过程即为酒精发酵，反应式为：C6H12O62C2H5OH＋2CO2通过对发酵醪液酒精含量的测定，可以判断酒精发酵的程度。酵母菌在有氧和无氧条件下的糖代谢的产物不同（好氧条件下生成水和二氧化碳），无氧条件下产生酒精和CO2，所以在酒精发酵时要杜绝氧气，否则酒精产率下降。三、实验材料及仪器1．实验材料：大米粉、玉米粉或甘薯粉等淀粉质原料，自来水，耐高温活性干酵母，耐高温α-淀粉酶，糖化酶，蔗糖，氯化钙，硫酸铜，亚甲基蓝，酒石酸钾钠，沸石。2．实验仪器：铝锅，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精蒸馏装置，恒温水浴锅，蒸馏烧瓶，酒精计，糖度计，滴定管，温度计，pH计，三角瓶，容量瓶，石棉网等。四、实验过程1、实验步骤（1）取自来水2000mL，按照1：4的料水比称取大米粉（500g），一起加入铝锅中，煮沸1h。注意不要煮糊，可适当补水，不要骤然降温，避免“夹生饭”。（2）用盐酸将醪液pH调节到5.5-6.0，加入CaCl25g（酶的保护剂）冷却到85℃，按10U/g大米粉的比例加入活化好的淀粉酶酶液，80℃-85℃恒温箱或水浴保温，用碘液检测其反应终点，达到终点时结束此反应过程。（3）用盐酸调节上述醪液至pH4.0-4.5，将醪液冷却到60℃，按150U/g大米粉的比例加入活化好的糖化酶酶液，60℃恒温箱或水浴保温6h以上（可放置过夜）。（4）用滤布过滤糖化好的醪液，弃去滤渣，滤液调节pH4.8-5.0，定容（加水或煮沸）到2000mL，冷却到20℃用糖度计测糖，取滤液测还原糖（方法见下文）。测糖后，将滤液分装到250mL三角瓶中，每瓶装液量为150mL，每组10瓶，121℃灭菌20min。（5）接种酵母：每瓶醪液接种活化好的酵母液10mL，用棉塞塞紧，包上两层牛皮纸。34℃恒温培养箱中培养，培养过程中，记录观察现象，同时取样测定酒精浓度和pH（pH计测定），每次取样两瓶，做两个平行样，取样间隔8-14h为宜，共取样6次，第一次在接种前，只测定还原糖和总糖浓度（酒精度为0，pH已经调好）。其余每次取样需要测定pH、酒精浓度、还原糖和总糖浓度，以便计算酒精得率等。2、酶和酵母的活化：（1）淀粉酶：用250mL三角瓶装自来水100mL，用0.1mol/L的盐酸调节pH到5.5-6.0（可用试纸测，此为淀粉酶作用的最适pH），共做3瓶，每瓶加入5g淀粉酶（称量时一定要碾碎），用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，35-40℃恒温箱保温30min，即为活化好的淀粉酶。（2）糖化酶：用250mL三角瓶装自来水100mL，用1mol/L的盐酸调节pH到4.0-4.5（可用试纸测，此为糖化酶作用的最适pH），共做3瓶，加入5g糖化酶，用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，35-40℃恒温箱保温30min，即为活化好的糖化酶。（3）酵母的活化：配置2％的蔗糖溶液700mL，用盐酸溶液调节pH4.5-5.0（酵母生长最适pH为4.8-5.0），分装到8个250mL的三角瓶，每个三角瓶中装蔗糖溶液80mL，121℃灭菌20min。灭菌后取出，冷却到40℃，以每瓶6g的量称取活性干酵母，加入酵母后38℃保温30min，即为活化好的酵母种子。整个过程尽量做到无菌。除酶外的器材尽量灭菌或在无菌操作台中操作。同时，要灭菌10mL移液管6支（或10mL量筒6个），接种时用。五、实验分析项目和方法1．测定液化反应终点(碘反应)取淀粉液化液数滴，滴加碘液进行检测。淀粉在α-淀粉酶的作用下，随着水解程度的加深，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。2．糖化终点测定(无水乙醇检验)取糖化液数滴，滴入无水乙醇中，看是否生成白色絮状物。若无白色絮状物生成，表明糖化比较彻底。3．酒精度的测定（参见实验附1）。4．还原糖浓度的测定（参见实验附2）。5．总糖浓度的测定：利用糖度计进行测定。将待测液转入量筒中，放入洁净、擦干的糖度计，再轻轻按一下（注意不要接触量筒壁），同时插入温度计，平衡约5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的糖度计示值和温度，查表，换算为20℃时样品的糖度。所得结果应表示至一位小数。6．pH值的测定：利用pH计测定。六、实验要求1、实验开始前，复习有关淀粉糖化和酒精发酵的相关理论知识，务必理解液化和糖化的原理，酒精发酵的原理和发酵过程的特点，了解酒精度测定和还原糖浓度测定的原理以及步骤。2、观察实验现象，尤其是淀粉糖化和酒精发酵过程的现象，记录并分析原因。3、详细记录实验的步骤和相关原始数据，并及时对原始数据进行整理和分析。4、测定发酵开始和终止时的糖浓度，结合酒精发酵的理论得率，计算本实验的得率，分析影响得率的因素。5、发酵过程中，间隔适当时间取样测定酒精浓度，记录酒精浓度变化情况，绘制酒精浓度变化曲线，并对曲线做分析。附1：酒精度的测定1原理试样以蒸馏法除去不挥发物质，用酒精计测定蒸馏液之比重。根据蒸馏液的比重查比重-酒精度对照表或直接从酒精计读数求得酒精含量（%，v/v）。2仪器2.1蒸馏仪器蒸馏烧瓶容积，500mL；冷凝器，套管长度不短于400mm；内管直径9mm。2.2酒精计量程为0-20或0-40（%，v/v）。2.3恒温水浴准确度0.1摄氏度。3操作取一清洁的100mL容量瓶，用被测试样荡洗2-3次。然后注满至近刻度，将容量瓶置于20℃水浴中20-30min，用20℃试样补足至刻度。将试样移入500mL（或250mL）蒸馏瓶，用50mL冷水分3次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。将烧瓶接入蒸馏装置。用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。为防止酒精挥发，在气温较高时蒸馏，应将容量瓶浸入（冰）水浴中，并使应接管出口伸入容量瓶的球部。当蒸馏液体积达到容量的90%左右时停止蒸馏。用少许水洗涤应接管的头端，洗液并入容量瓶。塞好容量瓶，摇匀。如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。置容量瓶于20℃水浴中30min，并用清洁的洗瓶或毛细滴管加同样温度的水至刻度，再次摇匀。蒸馏液用酒精计直接测定。由附录查得20℃时试样以体积百分比（v/v）表示的酒精含量。4说明蒸馏烧瓶中一定要加入沸石，蒸馏过程要全程观察，不允许出现烧瓶内溶液烧干的严重错误。蒸馏过程中乙醇蒸汽的逃逸，会严重影响测定结果的准确性。因此蒸馏前必须仔细检查仪器各连接处是否严密。若蒸馏中出现漏气，必须重新测定。蒸馏时，应先小火加热，待溶液沸腾后再慢慢用大火焰。对于易产生泡沫的酒样加少量消泡剂。但是加过消泡剂的试样蒸馏残液，不能用来作浸出物的测定。葡萄酒和啤酒试样的挥发酸过高时，会使测定结果引入较大误差。应根据总酸测定结果，用氢氧化钠溶液中和后，再进行蒸馏。附2：还原糖浓度的测定1原理：斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2↓+Na2SO4所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解。酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀。反应终点用亚甲基蓝指示剂显示，因为亚甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖立即使亚甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点。另外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反应终点更为明显。Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH2试剂2.1斐林试剂甲液：称取35g硫酸铜，0.05g亚甲基蓝，用水溶解并定容至1000mL。乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化钠，9.4g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至1000mL。2.20.1%标准葡萄糖溶液精密称取1.0000g经95~105℃烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，加入5mL盐酸，用蒸馏水定容至1000mL，摇匀。3仪器与设备三角瓶、容量瓶、分析天平、干燥器、电热恒温干燥箱、滴定管、称量瓶、移液管、电炉4测定步骤4.1斐林试剂的标定预备试验：吸取菲林试剂甲、乙液各5mL，置入250mL三角瓶中，加10mL水，快速滴入标准葡萄糖溶液，直至蓝色刚好消失，粗测总耗糖量为V0粗预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5mL，置入250mL三角瓶中，加10mL水，并从滴定管中预先加入V0粗-2ml的糖液，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4-5秒钟1滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成，总耗糖量为V0mL。4.2定糖预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5mL，置入250mL三角瓶中，加入适当稀释的试样稀释液摇匀，以下同标定时的预备试验操作，总耗糖量为V粗mL。正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5mL，置入250mL三角瓶中，加入适当稀释的试样稀释液摇匀，以下同标定时的正式试验操作，总耗糖量为VmL。重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值VmL。5计算还原糖（％）＝nCV0/V*100%式中V0：斐林试剂标定值(mL)V：斐林试剂测定值(mL)C：标准葡萄糖溶液浓度(克/mL)n：试样稀释倍数6说明(1)滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等，对测定精密度影响很大。平行测定的滴定mL数相差不应超过0.1mL，故在标定、预备、正式测定过程中，实验条件应力求一致。(2)滴定过程应该始终保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的mL数应控制在0.5~lmL内，否则应重新测定。(3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备试验结果，应将样品液稀释至还原糖的含量在1%左右为宜。(4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪色后，当接触空气时，又会被氧化重现篮色。附表1：原始记录模板生物工程07级班第组，组长：成员：时间现象操作记录人员附表2：实验相关数据记录（一）检测项目发酵时间（h）总糖浓度（%）酒精含量（%，20℃）发酵醪液pH值附表3：实验相关数据记录（二）发酵时间（h）V0（mL）V（mL）V1（mL）C（mL）n（mL）还原糖浓度（%）