MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用

实验报告生命科学中的细胞模型姓名：龙珍学号：201120285院系：药学院专业：药理学提交日期：2012年3月31日实验一ＭＴＴ法测定药物对细胞生长的抑制作用实验原理：ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测的吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。实验步骤：→→→→酶标仪测定(490nm处测其吸光度实验结果及讨论:1.不同浓度药物的生长抑制率如下贴壁细胞消化和吹打(加1ml0.5%胰蛋白酶并轻摇使其遍布所有细胞表面至镜下观察发现胞质回缩、间隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培养液,反复吹打至瓶壁上无贴壁细胞为止。)计数与分板(取20ul细胞悬液于计数板计数,用1640培养液调整使其细胞数约为1×105个/ml,在96孔培养板中加入细胞悬液每孔100ul,共18个,培养箱孵育12h。)加药与孵育(于培养板中分别加入浓度为0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml环磷酰胺注射液各100ul,每组重复3孔,设空白对照组3孔各100ul,孵育2~3小时。)MTT显色(每孔加MTT20ul，3小时候弃上清，每孔加DMSO100ul。)浓度（ug/ml）吸光度（x±s）抑制率（%）存活率（%）00.594333±0.14202801000.10.384333±0.0086635.333764.66630.20.505333±0.00577414.974885.02520.40.376±0.08198436.735863.26420.80.261667±0.00461955.973144.02691.60.207667±0.00173265.058934.94112.y=-14.452x2+24.585x+100.22R2=0.971702040608010012000.511.522.533.5lgc存活率(%)细胞存活率-药物剂量对数图IC50=679.218ug/ml3.讨论：○1.加药之前细胞贴壁效果不是很好，分布不太均匀，个别孔细胞有点聚集，加MTT之前药物抑制作用明显，尤其体现在是浓度为1.6mg/ml组。浓度为0.5mg/ml抑制相对明显，其他孔在形态上看不到太明显现象。○2.加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔间颜色较均匀，而且浓度为0.4ug/ml的颜色和其它孔之间也有区别，能够体现出抑制作用。○3最后通过酶标仪测得的OD值和上述观察到的现象较吻合。○4.前面已经说到细胞的贴壁效果不是很好，所以不能够完全判定药物的抑制作用，因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。实验二HE染色法观察药物作用细胞后的形态学变化实验原理：HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰显示出细胞图像,染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。实验步骤：1.样品制备:胰酶消化贴壁生长细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次。2.样品固定:95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。3.染细胞核:苏木精染色5-10min后自来水水洗。4.染细胞质:伊红染色1-2min后自来水水洗。5.脱水、透明:70%，95%，100%乙醇逐级脱水,二甲苯透明,吹干。6.封片:中性树脂封片。实验结果及分析:这是空白对照，可以看到细胞核细胞浆的染色比较漂亮，细胞核中的核仁数目是正常的，细胞核较完整，并且可以看到有个别细胞的细胞核皱缩，说明处于死亡状态。这是浓度为0.1mg/ml组，这组的药物抑制作用不是很明显，几乎与空白对照差不多。这组是浓度0.2mg/ml，药物抑制作用有体现，并有一处细胞核破碎，可看到有部分细胞核皱缩，这组的染色非常的漂亮。浓度为0.4mg/ml组，这组的细胞质染色较浅，并且看不清药物的抑制作用。浓度为0.8mg/ml，这一组的染色效果很好，但是也看不到药物的抑制作用，反而可以看到有很多的细胞正处于分化状态。（已经做标记）药物浓度1.6mg/ml，这组的细胞核染色较浅，整体上看不到抑制作用，并有个别细胞核进行分裂。综上所述，药物对细胞的抑制作用不明显，并且体现不出浓度趋势，但是整体的染色效果还算可以。实验三吖啶橙荧光染色法观察细胞形态学的变化实验原理：吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝色光或紫外光的激发下，DNA和RNA都会激发出荧光，活细胞经过固定，染色后细胞DNA成亮绿色，核仁和散布在细胞质中的RNA成橘红色，胞质的其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因为物质就够发生变化，其细胞核成暗绿色，细胞质也是成暗绿色。实验步骤：胰酶消化贴壁细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次,除去血清→95%乙醇固定15~30min→1%醋酸作用30s→1×10-4AO染色30s~60s→0.1MCaCl2处理30s~2min,PBS漂洗3次→PBS封片实验结果及分析：空白对照组，染色效果较好，可以看到个别细胞正在分裂浓度为0.1mg/ml,药物作用不明显，染色很漂亮，浓度为0.2mg/ml,与对照组没有明显区别浓度为0.4，能够观察到一点抑制作用，个别细胞的核仁变多，并且有个别细胞的细胞核发生边缘化，还有细胞出现空泡化。（已做标记）浓度为0.8mg/ml,药物作用不明显，但能看到空泡化，而且有细胞正在进行分化，还有分化刚刚结束，（请看标记）实验四TRIzol试剂快速分离细胞和组织中的RNA、ＤＮＡ、蛋白质实验原理：TRIzol试剂是目前最常用的细胞和组织中分离ＲＮＡ的试剂，其主要成分是苯酚，苯酚的作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白和核酸物质释放，由于ＲＮＡ极易被ＲＮａｓｅ分解，所以TRIzol中常加入８－羟基喹啉，异硫氰酸胍等来抑制内源性和外源性ＲＮａｓｅ活性，以保证ＲＮＡ完整。TRIzol试剂还利用RNA、ＤＮＡ、蛋白质在不同溶液中的溶解性质,加入氯仿离心后,溶液分为水相、中间层和有机相,取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中间层可回收DNA,用异丙醇沉淀可回收蛋白质,从而实现三者快速分离。实验步骤：样品处理:TRIzol处理后的样品在室温放置5min,每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s,室温放置3min,离心15min.样品分三层:底层为红色有机相,上层为无色水相和一个中间层.RNA主要在水相,中间层和有机层用于分离DNA和蛋白质。RNADNA蛋白质取2ul在核算微量检测仪上测量ＤＮＡ浓度另取２ｕｌ在琼脂糖凝胶中跑电泳试问晾干后NaOH溶解，再用TE，HEPES调节PH双缩脲试剂检验室温晾干后１％ＳＤＳ溶解蛋白质75%乙醇洗DNA沉淀后再离心取２ｕｌ样品用核算微量检测仪测量ＲＮＡ浓度放置干燥RNA沉淀，用无Rnase水在55-60度下溶解ＲＮＡ实验结果及分析：1、RNA电泳图如下：可以看到28s的亮度不够，甚至要比18s的亮度低，18s，5s比较正常，2.OD（260nm）/OD（280nm）浓度中间和有机相加无水乙醇沉淀后离心异丙醇沉淀蛋白质放置10分钟后离心２－８度１００００ｇ离心１０分７５％乙醇洗涤沉淀，离心异丙醇沉淀水相中的ＲＮＡ分离蛋白，DNA沉淀用含10%乙醇柠檬酸钠洗涤，室温放置5分后离心，弃上清重复一次95%乙醇洗涤沉淀，放置5分后离心，弃上清，重复两次，再用用无水乙醇同样方法洗一次DNA1.14180.3ng/mlRNA2.011763.9ng/ml3．蛋白质与双缩脲试剂的反应出现阳性结果，但是不是很明显。4.本实验得到的结果虽然都出现阳性结果，但是导致得到的物质的收率不是很高有以下几个原因:a)RNA的得率：样品匀浆时实际量太少，只是样品裂解不够彻底，RNA沉淀没有完全溶解，还有一些污染等原因导致RNA降解。b)DNA蛋白质得率：样品的匀浆和裂解的不彻底，得到的沉淀没有很好溶解,再就是得到的组织没有马上处理导致样品的降解。我们只有严格的按照试验的流程操作，从操作步骤，样品和仪器的准备，以及注意一些操作环境的维护的事项，这样才能够得到欲想要的大分子，进而进行后续的实验。实验五流式细胞仪凋亡分析ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７-ＡＤＤ双染色法实验原理：在凋亡的早期阶段，细胞内的钙离子快速持续上升，使谷氨酰胺转移酶被激活，造成胞质磷脂不对称丧失，导致膜内侧磷脂酰丝氨酸从细胞内层暴漏与外层，Ａｎｎｅｘｉｎ-Ｖ为３５－３６ＫＤ的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，并可被ＦＩＴＣ荧光物指标记，故ＡｎｎｅｘｉｎＶ被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标记之一，７－ＡＤＤ是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期和坏死的细胞，因为细胞膜受到破坏，而使细胞核染色。实验步骤：2ml(浓度为1×106/ml)细胞接种于6孔板/培养皿,培养24h后,加入合适凋亡诱导剂,设置空白对照1孔,加入同浓度药物各3孔(实验组)→进行细胞干预刺激24h,收集并用PBS洗涤,计数,离心→制备单细胞悬液,将细胞悬重于200ul的1×bindingbuffer中,每个样本浓度约为1×106/ml→100ul制备好细胞悬液加入到12mm×75mm试管→加入5ulＡｎｎｅｘｉｎ-Ｖ与７－ＡＤＤ于制备好细胞悬液中,混匀,室温孵育5min,加入400ul稀释后的bindingbuffer,1h内进行流式细胞仪检测→测定要做3管对照○1单纯细胞样本○2细胞样本只加入5ulＡｎｎｅｘｉｎ-Ｖ○3细胞样本只加入1ul７－ＡＤＤ→流式细胞仪测定:525nm测ＦＩＴＣ,675nm测７－ＡＤＤ,分析凋亡细胞、活细胞和坏死细胞百分率。实验结果及分析：这是没有做过药物处理的细胞，所以细胞落在左下象限，还有部分落在右上象限的是死细胞。这是经过药物处理的细胞，可以看到在右下象限出现荧光标记，说明细胞处于凋亡早期。在左上象限出现标记，说明药物处理的细胞处于凋亡中、晚期或是坏死细胞。这个图片比较全面，各个时期的细胞特征都能够体现出来，具体处于什么时期上面都已说明。