秸秆中纤维素_半纤维素和木质素的几种测定方法对比

秸秆中纤维素/半纤维素和木质素的几种测定方法对比陈贤情商晋宋慧芳郭康权（西北农林科技大学机械与电子工程学院，陕西杨凌西农路22号，712100）摘要：农作物秸秆的基本物理化学特性是的其综合利用重要依据。秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，其测定方法各有利弊。本文对比了几种不同测试方法和测试手段，从耗时、操作难易程度和数据可靠性等方面对纤维素、半纤维素和木质素的测定方法进行综合比较，给出了各测试方法的优缺点，并对几种改进方法作了介绍。其中，VanSoest方法比较简单实用，一般实验室都能进行，但结果准确性低并且过滤困难；王玉万法可以同时进行多个试样的分析，但测定纤维素含量偏高，半纤维素含量偏低；高效液相色谱法数据可靠，重复性好，但仪器贵，测试成本较高。关键词：秸秆，纤维素，半纤维素，木质素0引言中国秸秆资源丰富，但是大部分被当作肥料直接还田或者被当作燃料烧掉，随着科技的发展，一些较深层次的秸秆加工技术应运而生，如秸秆生物质气化技术、颗粒炭化技术、秸秆纤维的生物转化等。农作物秸秆的基本物理化学特性是的其综合利用重要依据，秸秆的基本组织是纤维素、半纤维素和木质素，其含量的多少为其综合利用提供重要依据。纤维素、半纤维素和木质素的测定方法有多种。VanSoest于1967年提出纤维素、半纤维素、木质素的测定程序，得到研究学者的普遍应用；1987年王玉万等提出了木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素、纤维素和木质素的定量测定分析程序；VanSoest于1991年对其方法进行了改进；李华针对VanSoest法进行了进一步改进，取得了良好的效果；国际可再生能源实验室发布了高效液相色谱法测定纤维素、半纤维素、木质素，测定结果比较可靠。本文对纤维素、半纤维素、木质素的几种测定方法进行了对比分析，旨在为测定秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素提供方法参考，为不同检测目的的学者提供选择依据。1方法原理1.1VanSoest法VanSoest法在国内又称范式法，它是将样品经中性洗涤剂煮沸处理，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为细胞壁成分，其中包括半纤维素、纤维素、酸不溶木质素和硅酸盐。样品经酸性洗涤剂处理，剩余的残渣为酸性洗涤纤维，其中包括纤维素、酸不溶木质素和硅酸盐，中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维的差值即为半纤维素含量。酸性洗涤纤维经72%硫酸处理后的残渣为酸不溶木质素和硅酸盐，从酸性洗涤纤维值中减去72%硫酸处理后的残渣为样品的纤维素含量。将72%硫酸处理后的残渣先干燥，再灰化，在灰化过程中逸出的部分为酸性洗涤木质素的含量。1.1.1王玉万法王玉万的系统分析程序是将中性洗涤剂法与2M盐酸水解法、地衣酚比色法、72%硫酸法、蒽酮法和差重法综合应用。具体是：用中性洗涤剂将样品中的杂质（蛋白质、脂肪、淀粉、糖等）去除，用2MH2SO4法将半纤维素水解，然后用地衣酚比色法测定木糖的含量，转换为半纤维素的含量，再用72%H2SO4水解法将纤维素水解，用蒽酮比色法测定还原糖的量，再转化为样品中纤维素的含量，最后用差重法，及将剩余的残渣（包括酸不溶木质素和硅酸盐）先干燥称重，再灰化，称重，用前后重量之差得出酸不溶木质素的含量。1.3高效液相色谱法高效液相色谱法是结合72%H2SO4水解法、差重法与高效液相色谱仪的综合应用。先将样品用72%H2SO4水解，不容残渣（主要包括酸不溶木质素和硅酸盐）用差重法测定酸不溶木质素的含量，滤液经过一系列中和及过滤处理，进入高压液相色谱系统，结合标准曲线法，测定各种单糖的含量，进而转化为样品中纤维素、半纤维素的含量。2试验内容和方法试验于2011年在陕西杨凌进行，选取了小麦秸秆、棉花秆、玉米秸秆的叶子、髓心、皮为试验素材，对每个样品分别用VanSoest法、王玉万法、高效液相色谱法测定，每种方法重复测定4次，测定结果取平均值。2.1VanSoest法2.1.1中性洗涤纤维测定准确称取1.000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml中性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。煮沸完毕后，取下直筒烧杯，将烧杯中溶液倒入安装在抽滤瓶上已知重量的玻璃坩埚中进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直到洗至滤液呈中性为止。用20ml丙酮冲洗二次，抽滤。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30min称重，直称至恒重。2.1.2酸性洗涤纤维测定准确称取1.000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml酸性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30min称重，直称至恒重。2.1.3酸性洗涤木质素和酸不溶灰分（AIA）测定将酸性洗涤纤维加入5ml72%硫酸中，在20℃消化3h后过滤，并冲洗至中性。消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后称重，即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。2.1.4结果计算中性洗涤纤维含量的计算：NDF（%）=（W1－W2）/W×100式中：W1—玻璃坩埚和NDF重（g）；W2—玻璃坩埚重（g）；W—试样重（g）酸性洗涤纤维含量的计算：ADF（%）=（G1－G2）/G×100式中：G1—玻璃坩埚和ADF重（g）；G2—玻璃坩埚重（g）；W—试样重（g）半纤维素含量的计算：半纤维素（%）=NDF（%）－ADF（%）纤维素含量的计算：纤维素=ADF（%）－经72%硫酸处理后的残渣（%）酸性洗涤木质素（ADL）含量的计算：ADL（%）=经72%硫酸处理后的残渣（%）－灰化后的灰分（硅酸盐,%）2.2王玉万法王玉万的纤维素、半纤维素、木质素定量分析程序见图1。2.3高效液相色谱法2.3.1将坩埚置于马弗炉中575℃烘4h，之后与干燥器中冷却，恒重，记下重量，再将坩埚置于马弗炉中575℃烘干1h，干燥器中冷却，恒重，再记下重量，前后两次重量之差小于0.3mg2.3.2称取0.300g±10mg样品与试管中，同时做上重复，进行标记，每支试管中加入3.00±0.1ml72%的H2SO4，搅拌1min，在30℃水中水浴60±5min，每隔5~10min搅拌一次，使其充分水解2.3.3用已经称量至恒重的坩埚将水解液真空过滤，将滤液备用（用来测定半纤维素、纤维素）2.3.4用去离子水将滤渣定量转移到过滤坩埚中，用50ml热去离子水洗涤残渣，将坩埚和残渣置于105℃烘4h，直至恒重，再将其转移到干燥器中，记录重量，再将坩埚和残渣置于马弗炉中575±25℃烘24±6h，完了在干燥器中冷却，再次称重，前后两次重量的差值就是酸不溶木质素的含量。2.3.5取滤液20ml于50ml烧杯中，用CaCO3中和至pH5~6,最多不能超过6，然后将样品过0.2微米滤膜，再注入高压液相色谱的自动进样器，2.3.6高压液相色谱柱分析条件：图1半纤维素、纤维素、木质素的定量分析程序1.样品0.5000g置于100ml碘量瓶中，加入50ml中性洗涤剂，之后放入已沸的高压蒸汽消毒器中，100℃保温1h，取出用3号砂芯漏斗过滤，残渣用水丙酮洗残渣滤液2.置于100ml碘量瓶中，加入50ml2M盐酸溶液，然后放入已沸的高压消毒器中，100℃准确保温50min，之后用3号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至pH6.5-7.0滤液残渣3.适当稀释，取1ml加4ml地衣酚试剂，100℃保温20min，于660nm测定OD，由木糖标准曲线求出糖量，乘上系数0.94.用丙酮洗2次，60℃干燥，然后置于50ml烧杯中，加入5ml72%的H2SO4，20℃水解3h，然后加入蒸馏水45ml，室温过夜，次日用已经称恒重的3号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至pH6.5半纤滤液残渣5.适当稀释，取1ml加4ml蒽酮试剂，100℃保温10min，于620nm测定OD，由葡萄糖标准曲线求出糖量，乘上系数0.96.于80℃烘干，称重之后，550℃灰化，得灰分纤维木质进样量：10~50μl流动相：色谱级的去离子水，过0.2μm滤膜，脱气流速：0.6mL/min柱温：80~85℃检测器温度：接近柱温检测器：示差折光检测器运行时间：35min2.4数据分析方法数据以X±S表示,采用统计软件SPSS13.0进行显著性分析。3结果与分析3.1耗时表13种测定方法耗时比较样品煮沸时间烘干水解时间过滤时间灰化总计VanSoest法25342438（h）王玉万法2.561122445.5（h）高效液相色谱法—9112435（h）VanSoest法第一步由于果胶质、蛋白质、淀粉的去除不完全，过滤比较困难，耗时较多；王玉万法由于加了72%的硫酸水解之后，要稀释，再过夜水解，耗时最多，达到45.5h；高效液相色谱法在烘坩埚的时候耗掉的时间比较多，达9h，此时耗能也较多。三种方法灰化测定木质素的时间是一样多的，都是24小时。3.2操作难易程度表2三种方法对仪器的特殊要求样品特殊要求VanSoest法—王玉万法—高效液相色谱法配有示差折光检测器的高压液相色谱仪VanSoest法和王玉万法操作比较简单，一般实验室都能进行，这也是广大学者应用比较多的方法；高效液相色谱法测定中需要配有示差折光检测器的高压液相色谱仪，不论高压液相色谱仪器，还是示差折光检测器价格都比较昂贵，此方法只被一部分研究所和高校采用。3.3数据可靠性表3纤维素测定结果纤维素含量/(%)样品VanSoest法王玉万法高效液相色谱法小麦秸秆18.24±0.9219.34±0.2818.72±0.04棉花杆13.61±0.5717.08±0.8515.11±0.02玉米皮13.57±0.8415.28±0.6414.51±0.09玉米叶子17.76±1.3820.47±1.3719.61±0.03玉米髓心13.88±0.8515.27±1.3714.49±0.19由表3分析可得：高效液相色谱法误差限比较小，方法准确；VanSoest法、王玉万法误差限较大，准确度不如高效液相色谱方法，其中王玉万法在用2MH2SO4将半纤维水解时候，水解的不完全，导致一部分半纤维素进入纤维素的测定程序，用72%的H2SO4水解纤维素时候，残余的半纤维素也水解掉，导致纤维素含量偏高，半纤维素含量偏低（可见表5）。表4纤维素测定方法结果显著性比较VanSoest法王玉万法高效液相色谱法VanSoest法王玉万法0.009高效液相色谱法0.0150.015由纤维素测定方法结果显著性比较（见表4）可得：VanSoest法与王玉万法测定结果差异达到极显著水平（P0.01），VanSoest法与高效液相色谱法测定结果差异达到显著水平（P0.05），高效液相色谱法与王玉万法测定结果差异也达到显著水平（P0.05），可见三种方法测定纤维素的结果还是有很大差异的。表5半纤维素测定结果半纤维素含量/(%)样品VanSoest法王玉万法高效液相色谱法小麦秸秆23.26±0.9321.05±0.8822.84±0.08棉花杆44.07±0.835.36±1.1736.67±0.44玉米皮30.09±0.3625.9±0.626.65±0.31玉米叶子21.82±0.4518.05±0.519.17±0.03玉米髓心22.66±0.3420.49±1.3721.83±0.21由表5分析可得：高效液相色谱法误差限小于VanSoest法、王玉万法，其原因在于高效液相色谱法的误差中，人为因素比较少，VanSoest法、王玉万法的误差中操作人员带来的误差占相当一部分。从测定结果来看，VanSoest法在测定过程中由于第一步中性洗涤剂将果胶质、蛋白质、淀粉去除的不完全，不仅导致过滤比较困难，还导致半纤维素的测定含量偏大，王玉万法测定的半纤维素含量则偏少。表6半纤维素