PPT―高效液相色谱

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）一、前言HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支，现已成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的分离分析手段。我国：课时安排：第一章：高效液相色谱的基本原理6学时第二章：高效液相色谱的仪器装置2学时第三章：液固、液液、键合相色谱4学时第四章：离子交换色谱和离子对色谱3学时第五章：凝胶渗透色谱1学时第六章：实验技术和辅助实验技术2学时机动2学时实验安排：实验一：样品保留值的重复性测定实验二：流动相极性变化对溶质保留值的影响实验三：试样中苯甲酸的定性分析参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用（色谱技术丛书、化学工业出版社、于世林编著)第一章、高效液相色谱的基本原理§1-1概述一、发展历史1903年提出、1969～1970年开始发展流动相－－液体基本原理：在经典液相色谱基础上，引入气相色谱理论技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化工作原理：通过高压泵，连续地将流动相按一定流速流过柱子；通过进样器，注入样品混合物。由于混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。通过检测器检测，得到组分的电信号并进行放大；记录仪将放大的电信号以图形形式记录下来。高效液相色谱法特点：1.高压：一般：150～300kg/cm2甚至：500kg/cm22.高速：两相间交换：千分之几秒分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟)3高效：气相：2000塔板/米液相：5000塔板/米4.高灵敏度：紫外检测器：10－9g数量级荧光检测器：10－11g(百万分之几）试样量小（几微升）5.高选择性：可分析在性质上极为相似化合物（手性化合物、同位素、同分异构、空间异构）与气相色谱比较：相同点：都是重要的分离、分析手段气相的基本理论（塔板理论、定性定量方法）基本术语（色谱参数、色谱图、色谱柱效）不同点：ⅰ应用范围：气相：易挥发、热稳定液相：不易挥发、热不稳定但具有一定溶解性化合物，不适合气体。ⅱ流动相作用：气相：运载样品，不影响色谱分离液相：运载样品，参与、影响色谱分离，且起主要作用。ⅲ分析样品：气相：破坏样品，不能回收。液相：不破坏样品，能回收。说明：HPLC的分类：ⅰ液固吸附色谱（LSC)（利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离）ⅱ液液分配色谱（LLC）（利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度不同而分离）（键合相色谱60％）ⅲ离子交换色谱（IEC）（利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固定相的亲合力不同而分离）ⅳ体积排阻色谱（SEC)（利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不同而分离）§1-2色谱分离和保留值一、色谱过程定义——由于样品中各组分在不互溶的两相间平衡分配的不同，在色谱柱中进行分离的过程固定相：柱中固定不动移动相：流过柱子的液体综合来看：不同组分分离状况取决于：ⅰ热力学平衡问题：各组分分配系数、吸附力、亲合力之间差异——影响出峰时间ⅱ动力学平衡问题：溶质扩散系数、填料颗粒、填充情况、流速——影响峰形色谱过程特点：ⅰ组分经无数次平衡分配后，在柱的流出液中浓度对分离时间呈高斯曲线型ⅱ色谱条件一定时，各组分都有特定时间在图谱中出现，称为保留时间tR。ⅲ柱效一定时，保留值越小，峰窄；保留值越大，峰宽。ⅳ相邻峰间tR相差越大，组分间越易分离二、容量因子和保留值色谱的保留作用——化合物进入柱内，即在两相间不断进行平衡分配，由于不同化合物理化性质不同，在两相中存在量也不同。固定相中量多，柱内保留时间长；流动相中量多，柱内保留时间短。容量因子k′——某一组分平衡时，两相中存在量的比值。要得到理想分离，k′应保持在1～10之间k′太小——没有充分利用填料的分离能力。k′太大——分析时间太长。§1－3色谱柱的分离效率分离过程基本理论：ⅰ各组分在两相间分配情况：tR——由色谱过程的热力学因素所控制ⅱ各组分在色谱柱中的运动情况：Y1/2——由色谱过程的动力学因素所控制一、理论塔板数N二、理论塔板高度H三、峰扩展和速率方程式峰扩展——某一组分流过时，经过多次平衡分配，使开始处于“浓缩”状态的组分被移动相稀释，最后得到有一定宽度的色谱峰，称之。柱外因素：ⅰ检测器流动池体积ⅱ柱出口到检测器的连接管ⅲ进样器死体积柱内峰扩展影响因素：①涡流扩散减小措施：ⅰ颗粒大小保持一致ⅱ填装均匀ⅲ尽量采用球型填料涡流扩散随柱长增加而增加，与流动相流速无关。②分子扩散减小措施：加大流动相流速③传质——溶质分子在两相间浓度的不同，从浓度高的相，不断迁移至浓度低的相，直到浓度达到平衡，这种质量迁移过程称之。ⅰ固定相传质：⑴固相固定相⑵液相固定相ⅱ移动相传质：⑴迁移移动相⑵滞留移动相获得高柱效的几种方法：①选用细的颗粒填料②流动相流速低③流动相粘度小④升高温度溶质扩散系数与其结构有关ⅰ大分子，扩散系数小ⅱ小分子，扩散系数大§1－4分离度Rs（Resolution)一、分离度影响因素①峰的宽度（峰宽越小，Rs越大）峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性②两峰的保留时间之差（△tR越大，Rs越大）反映了色谱分离的热力学特性二、控制分离度方法①改变k’②更换色谱柱（改变N）③改变选择性系数三、分离度控制的一般原则第二章仪器装置液相色谱仪可分为四大系统：泵系统进样系统分离系统检测系统§2－1泵系统作用：向色谱柱输送一个连续、恒定的移动相。一、对泵系统的要求1.使用方便（易调节流量、过压保护等）2.更换洗脱液容易、死体积小3.有最大工作压力4.一定流量范围（0.1~10ml/min)5.流量稳定性好6.流量精度高泵系统泵系统发展趋势①高效：填料颗粒↓→分离效率↑→柱压降↑→泵的工作压力↑②分析时间短：更快流速→柱压降↑③减少洗脱液用量④液相色谱的多元洗脱系统§2－2分离系统（色谱柱）组成：精密管径的不锈钢管、填料、柱接头要求：①柱管内壁非常光滑②柱接头设计要保证系统中引入最小死体积③能密封高压液体④两端加过滤片柱效的影响因素①填料的颗粒度及其均匀性②柱长、填装的方法与技巧常用：内径2－5mm（4.6mm)柱效一定时，柱长与颗粒度成正比例如：颗粒度5～10um、柱长15～30cm颗粒度3～5um、柱长7.5～15cm进样系统§2-3检测系统功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间变化的情况，转变成大小不同的电信号输入到记录仪中，得到色谱图。按检测方式不同，分为：①总体性质检测器（通用型）示差折射检测器、电导检测器②溶质性质检测器（选择型）紫外检测器、荧光检测器一、检测器的性能指标一个理想检测器，必须具备下列条件：①灵敏度高②不受温度及流动相流速变化的影响③响应随组分量的变化而线性地变化④稳定性好，操作方便性能指标：①灵敏度S=△R/△Q②最小检测限（检测下限）③线性范围－检测信号呈线性变化时，最大和最小进样量之比④噪音－在没有样品情况下，检测器输出的最大振幅⑤漂移－检测器在一段时间内，基线随时间的增加而产生的偏离检测系统紫外检测器优点：①灵敏度高（10－10g/ml)②对梯度洗脱是一种理想检测器局限性：①不能检测对紫外光没有吸收的样品②不能使用对紫外光有吸收的溶剂PAD检测器第三章、液固色谱、液液色谱、键合相色谱§3－1液固吸附色谱一、原理:固定相是极性吸附剂，由于不同官能团样品具有不同极性，因而对固定相的吸附能力不同。极性越大，吸附能力强；极性越低，吸附能力越弱而导致分离。分离对象：①官能团有差别的不同类型化合物②几何异构体（由于固定相表面是刚性结构，即吸附中心处于吸附剂表面一定位置上。溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变，当官能团与吸附中心对准，作用就强。）二、填料的类型及其选择①按形状分：a.球形b.无定形②按多孔程度分：a.多孔型b.薄壳型③按极性分：a.极性b.非极性三、硅胶的活性控制及标准化市售未处理硅胶→加热4－6小时，活化去水。再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。四、吸附强度分类根据化合物结构类型，可将它们在硅胶上的吸附强度排序：P186归纳：①官能团不同→极性不同→吸附强度不同②几何异构体→空间位置不同→吸附强度不同五、流动相选择的实用要求①溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性②避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂③流动相应与检测器相匹配④使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收LSC流动相分类⑴根据所起作用分为：①底剂②洗脱剂⑵根据氢键、酸碱性基团分类：①无氢键型②斥电子氢键型③吸电子氢键型④具斥、吸电子双重性的氢键型⑤酸类⑥碱类LSC流动相的选择流动相作用：把吸附剂吸附的溶质洗脱下来溶剂强度ε。↑→洗脱能力↑→k’↓溶剂强度参数ε。序列：P174混合溶剂优点：①获得最佳分离选择性②移动相粘度低§3－2液液分配色谱和键合相色谱一、液液分配色谱（LLC)定义－以一种液体作固定相，它均匀地涂敷在大小一致的小颗粒惰性担体上。另一种液体作移动相。涂敷在担体上的固定相应与移动相极性有很大差别，即两者不相溶。1.原理：溶质分子X在固、液两相中存在分配平衡K＝[X]S/[X]m，不同的溶质在两相中有不同的分配系数K，因而在两相中有不同的溶解度。在固定相中溶解度大，tR↑；在移动相中溶解度大，tR↓。2.固定相要求：溶质在固定相中溶解度大于移动相防止固定相流失很重要，采取措施：①移动相使用前，先预饱和。②避免使用对固定相有中等溶解度的移动相③整个色谱体系的稳度必须恒定④注意配制样品溶液的溶剂特性注意点：①对有不同长度侧链的多环芳烃，宜用反相色谱分离。②在相同条件下，流动相组分变化对有取代基的多环芳烃的保留影响较大。3.流动相选择①对固定相无损害②不宜采用梯度洗脱常见：乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷二、键合相色谱定义－固定相通过某种化学反应将有机分子以共价键结合在色谱担体的表面，这种色谱类型称之。制备硅胶基质化学键合固定相，注意：①键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水解为硅烷醇。②除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自由硅醇基。形成化学键合固定相，必须具备条件：①所用基质材料应有某种化学反应活性②有能与基质表面发生化学反应的官能团键合相反应类型：P303目前最广泛采用的化学键合固定相：硅烷化合物（存在Si-C键）使反相色谱的应用范围远远超过正相色谱反相色谱的保留机理①疏溶剂理论②双保留机理分离对象：①同系物：烷烃数↑→tR↑直链tR＞支链tR②化合物极性↑→tR↓固定相对组分保留的影响：①碳链长度：碳链↑→tR↑②烷基覆盖量：覆盖量↑→tR↑反相色谱中流动相选择水＋有机改善剂常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环极性：有机改善剂＜水洗脱能力：有机改善剂＞水极性顺序：甲醇＞乙腈＞二氧六环＞四氢呋喃洗脱顺序：水＜甲醇＜乙腈＜二氧六环＜四氢呋喃反相键合相色谱的优点①流动相可选用水溶性ⅰ.样品的溶解度范围提高ⅱ.流动相可变性大ⅲ.柱重现性好②固定相表面化学能低ⅰ.平衡容易ⅱ.梯度洗脱③固定相选择多④固定相耐溶剂冲洗⑤热稳定性好缺点：①流动相PH范围要控制（PH＝2－8）PH太低：Si-C键易断裂PH太高：硅胶基质易溶解②游离的硅羟残基影响分离色谱选择性解析熟练应用HPLC技术→仔细研究和解析大量色谱图→找出固定相－溶质－移动相三者间相关规律。通过解析，可以得到：①未知化合物极性大小②溶解度参数③空间位置阻碍等方面知识1.色谱分离选择性的物理概念色谱系统的物理化学参数①固定相的表面化学性质②流动相性质和浓度③温度分子间作用力有三种：①定向作用力（取向力）②极化作用力（诱导力）③分散作用力（色散力）影响氢键大小因素：①随与H相结合的原子电负性的降低而降低②只有电负性较强的原子才可与X-H形成氢键③氢键形成难易与空间位阻有关第四章离子交换色谱、离子对色谱§4－1离子交换色谱一、原理：以离子交换剂为固定相，与流动相中离子型物质发生可逆的离子交换，根据溶质离子、离子交换固定相、流动相离子之间相互作用力的差异而导