流式细胞术课件

流式细胞术郭素娟生殖生物学实验室2018.6.8第一节流式细胞术概述流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。BDLSR通过流式细胞仪我们可以得到以下信息-相对细胞大小-相对细胞颗粒密度和内部复杂度-染色过细胞的相对荧光强度细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性基础研究淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究临床研究淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度第二节流式细胞仪工作原理采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。一、工作原理基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程现代流式细胞仪包括液流系统聚焦细胞以供检测光学系统激发和收集光信号电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析细胞分选系统由样本和鞘液组成待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。1.液流系统液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）2.光学系统FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光学系统示意图流式细胞仪的光信号散射光信号荧光信号(2)散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光——FSCForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser侧向角散射光——SSCSideScatterFALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图——DotPlotlysedwholeblood测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器（3）荧光测量荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光检测器FreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)主要由计算机及其软件组成3.电子系统4.细胞分选系统FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第三节流式细胞术数据显示FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少参数单参数直方图双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置数据显示方式双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式第四节流式细胞样品制备标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml可选的抗凝剂有：标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。第五节流式细胞荧光标记选择合适的荧光染料必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少抗体使用原则根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC使用双标以上抗体必做荧光补偿FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类几种常见的荧光染料名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texasred568红615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PEcy5488红670易不敏感减少交叉，成本高常用的几类荧光染料第六节凋亡细胞的检测细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学及分子生物学性质的变化,包括细胞皱缩,核染色质凝聚,细胞膜通透性改变,诱导蛋白酶凋亡分子激活,线粒体跨膜电位降低,膜磷酯酰丝氨酸外化,胞质Ca2+浓度升高,DNA片段化及含量变化等特点,进行定性、定量测试分析,从而实现对细胞凋亡的准确测定。FlowcytometryofapoptoticcelldeathFlowcytometryofapoptoticcelldeath荧光吸收细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞FlowcytometryofapoptoticcelldeathFCMofCaspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测使用特异性的caspase-3荧光底物新的抗原决定基CK18Flowcytometryofapoptoticcelldeath线粒体功能的变化TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123,DiOC6,JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探针。当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白——7A6抗原会出现Bcl-2/baxfamilyofproteins.Flowcytometryofapoptoticcelldeath钙离子流和pH值变化胞浆内Ca2+水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。使用Ca2+选择性荧光探针，如Quin-2,Fluo-3,Indo-1通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如DCH,BCECF,BCECF-AM,SNAFLs,SNARFs等进行检测FlowcytometryofapoptoticcelldeathPhospholipidredistribution第七节细胞周期的检测原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。（n----2n）以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有G1期，S期,G2期和M期。FlowcytometryofcellcycleG1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成,DNA数目为n.S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目从n变为2n.G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备DNA数目为2nM期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n，分裂后期DNA数目变回n。从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，s期，G2/M期Flowcytometryofcellcycle一般利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果G0/G1期处于50的位置，那么G2/M期处于100的位置。期间的为S期FlowcytometryofcellcycleFlowcytometryofcellcycleTHANKYOU