抗体工程要点

抗体工程抗原的来源•生物组织纯化蛋白的纯化方法：1.离子交换2.凝胶过滤3.亲和层析4.输水作用层析等。抗原的来源•人工合成（化学方法）1.半抗原的合成2.抗原多肽的合成：多肽合成仪抗原的来源•蛋白的重组表达1.原核细胞的表达方法：大肠杆菌，枯草杆菌。2.酵母细胞的真核表达方法：甲醇毕赤酵母的重组表达。3.昆虫细胞的表达：杆状病毒表达载体。4.哺乳动物细胞的表达：CHO，HEK293。5.抗原的单独表达和融合表达。6.表达标签（TAG）：Fc标签，HIS标签，FLAG标签（DYKDDDDK），C-MYC标签，GST标签等。原核表达系统•质粒：1.多克隆位点（MCS）2.抗性基因3.启动子（P）4.复制起始位点（Ori）原核细胞的表达•操纵子表达模型与启动子：酵母真核细胞表达系统酵母表达系统的优缺点：1.操作简便。2.表达量高。3.培养条件简单。4.易于纯化。5.N-端可能会有氨基酸缺失。6.存在过量糖基化的可能。昆虫杆状病毒表达系统哺乳动物细胞表达系统•稳定表达细胞系：CHO细胞•瞬时表达细胞系：293细胞•载体：1.原核载体骨架2.真核启动子3.增强子4.多克隆位点5.PolyA信号6.真核细胞筛选标志7.加压筛选基因哺乳动物细胞表达系统的特点•可以分泌表达，活性高。•纯化步骤可能比较复杂。•糖基化比较正常。•成本较高，表达量偏低。•周期较长。•可以建立无血清培养的方法。第三章抗体分子的结构和分类CDR区：互补决定区FR区：框架区重链分子量：450-550个氨基酸残基构成，45-70kd轻链分子量：大约214个氨基酸残基构成，22-24kd抗体分子片段抗体分子的分类IgA和IgM的J链，IgA的分泌片IgG：1,2,3,4.bacteriaAb+antigenaggregatesareingestedbyphagocyticcellsvirusesTheycanrecognize:CancercellsProteins,carbohydrates,smallmolecules,etc,etc.Antibodiestendtoaggregatetheirtargets(viruses,cells)(proteins)Whatcanantibodiesdo?Xenotransplantation,Autoimmunodiseases特殊的抗体分子•卵黄抗体IgY：由两条重链（H）和轻链（L）组成，重链（υ）由一个可变区（V）和4个恒定区（C）组成，没有铰链结构。完整分子量为180KDa（7.8S），重链为67－70KDa，轻链为25KDa，但还存在一个小体积副本，120KDa（5.7S），发现于野鸭和某些龟类中。克隆IgYH链表明，较小的IgYH链缺乏C3、C4区，称为IgY（△Fc）单域抗体特点：1.见于驼类动物，软骨鱼类2.没有轻链多肽。3.CDR3区较长。4.驼类单域抗体没有CH1.5.去除Fc片段后称为纳米抗体。抗体的生物学功能•特异性的结合抗原•激活补体•结合Fc受体1）调理吞噬作用：巨噬细胞。2）介导过敏反应：肥大细胞。3）ADCC作用：NK细胞、单核细胞。4）穿过胎盘和粘膜5）免疫调节。抗体的来源•抗体的定义•抗体的发现：1888年EmileRoux和AlexanderYersin发现了白喉毒素，1890年VonBehring发现，白喉毒素或者破伤风毒素免疫动物后，血液中可以产生阻止毒素诱发疾病的物质，称为抗毒素（antitoxin)。•电泳分析gamma球蛋白（并不全是抗体）•1972年世界卫生组织和国际免疫学联合会把具有抗体活性及化学结构与抗体类似的一类球蛋白，统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin)。人血清球蛋白的电泳图谱白蛋白a1a2bg白蛋白a1a2bg抗体生成的理论•1897年，PaulEhrlich提出了侧链学说，他认为细胞表面有特异性受体分子，可以释放的血液里面，就是抗毒素（抗体）。•1930年，Breinl和Haurowitz提出模板学说，认为抗原是抗体合成的模板。•1955年，Jerne提出天然抗体选择学说，抗原抗体的复合物刺激细胞产生更多针对该抗原的抗体。•1958年，Macfarlane，Burnet，DavidTalmadge和Joshua提出了克隆选择学说，每一个产生抗体的细胞克隆（B细胞）只能产生一种抗体，抗原与B细胞表面的膜型抗体分子结合，刺激B细胞的增殖分化，浆细胞，生产更多的抗体。Clonalselectiontheory细胞凋亡（apoptosis：Caspase）细胞自噬（autophagy：溶酶体）人体内可以产生10E12以上不同的抗体分子，为什么？第四章抗体的基因及其表达•抗体重链基因簇（IgH):14号染色体，1.5Mb•抗体轻链Kappa基因簇（IgK）：2号染色体，800kb。•抗体轻链Lamda基因簇（IgL）：22号染色体，700kb)。抗体重链的基因及其表达V基因：51个J基因：6个D基因：27个C基因：10个RNAalternativesplicing轻链的基因与重排V基因：30个J基因：4个C基因：4个V基因：40个J基因：5个C基因：1个抗体基因重排的机制RSS：rearrangementsignalsequence重排信号序列12/23规则RAG:recombinationactivatinggeneRAG1和RAG2异源二聚体TdT：terminaldeoxynucleotidyltransferase末端脱氧核苷酸转移酶抗体类别的转换S区介导的二次重排：switchingregion，除了Cd外，其它C基因前都有S区序列。抗体多样性的原因•多种不同的基因片段。•不同重链和轻链的随机取用和组合。•VDJ基因片段重组时连接的多样性，连接区的核苷酸插入。•体细胞的高突变频率。抗原与抗体的相互作用•6个CDR区，非共价结合抗原，空间可变结构的结合。•作用特点：1.特异性2.可逆性3.有量效关系。抗体的制备多克隆抗体：抗血清血清与血浆抗体的滴度单克隆抗体：由单一细胞克隆分泌的，识别同一个抗原决定簇，结构与功能都完全相同的抗体。基因工程抗体：通过基因工程方法生产或者改造过的抗体分子，一般采用工程细胞进行表达。免疫血清的制备方法•免疫血清的要求：效价高，特异性强。•抗原的纯度•免疫佐剂•抗原的分类：颗粒型，可溶胶体。•抗原和半抗原：40kd,半抗原6000以下。•抗原的纯化方法：层析，电泳。半抗原与载体蛋白的偶联•常用的载体蛋白：BSA，OVA，KLH•偶联机制：1）形成酰胺键2）氨基间形成连接桥（NH-R-NH）3）形成偶氮键（-N=N-）：如酪氨酰、组氨酰、赖氨酰残基间。4）对于没有羰基和氨基的半抗原，引入连接基（spacer），再与蛋白偶联，甲醛等。佐剂的使用•氢氧化铝佐剂（适合人用疫苗）•明矾佐剂•石蜡油、羊毛脂等。•抗原的乳化方法：1）研磨法2）注射器乳化法3）超声乳化4）复合乳剂：增加2%的Tween-20生理盐水，机械或者超声乳化。动物的免疫•需要考虑动物种系、抗原剂量、免疫途径、加强免疫的时间、免疫次数和佐剂的使用。•用于免疫的动物：兔、大鼠、小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、鸡、山羊、马、驴、猴等。1）抗原与动物种属的关系2）动物的生理状态3）血清的用量•抗原的用量：兔0.5-1mg/kg体重。小鼠：10-100ug。•免疫途径：静脉=脾脏=淋巴结腹腔肌肉皮下皮内。•加强免疫（boost）：每隔2-3周免疫1次，2-3次后，1周后检测血清中的抗体滴度，然后可以放血，制备抗体。•免疫方案：皮下多点注射。第1次福氏完全佐剂，后面福氏不完全佐剂。福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分成分完全佐剂不完全佐剂石蜡油6份++无水羊毛脂4份++杀死的分枝杆菌3-5mg+-磷酸缓冲溶液10份++（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）抗体在动物血清中的表达水平多克隆抗体的制备和保存•动物的放血：心脏取血，耳缘静脉采血（兔），尾尖取血，眼底取血（小鼠，大鼠），颈静脉取血（大型动物，羊，羊驼）。处死动物取血的方法：颈动脉取血，摘眼球取血。血清的分离：冰箱放置过夜，3000rpm,30min,吸取血清，加入叠氮钠或者硫柳汞防腐剂，-20或者-80度长期保存。多克隆抗体的粗提：辛酸饱和硫酸铵沉淀法•将待提取样品用60mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液稀释3～4倍，调pH至4.5，对含脂质较高的标本可采用二氧化硅粉或玻璃纤维吸附法除去脂质。•在室温下边搅拌边缓慢加入正辛酸，按每ml样品中加25μl，若样品体积小于5ml，则每ml样品内加入30μl正辛酸，搅拌30min。•10000×g离心30min，取上清液通过定性滤纸过滤，装人透析袋，用20倍体积的PBS，4℃透析过液，中间换液3～4次。•然后每毫升混合液加0.27g硫酸铵，搅拌30min。•以5000g离心15min，收集沉淀物，溶于少量PBS中，再以15000×g离心20min。上清液即为提取的Ig，其中大部分为IgG，约占90％，少量为IgA及IgM，回收率80％。整个操作可在24h内完成。DEAE纤维素精制多克隆抗体•蛋白标本对0.005mol/L，pH8.6Tris-PO4透析。•DE52装柱，并以0.005mol/L，pH8.6Tris-PO4平衡。•加样，以0.005mol/L，pH8.6Tris-PO4洗脱，紫外监测直至洗脱液280nmOD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。•以350ml，0.055mol/L，pH6.0Tris-PO4洗脱，这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。•以125ml，0.055mol/L，pH6.0Tris-PO4和125ml0.5mol/L，pH5.1Tris-PO4梯度洗脱，总量收集250ml；重复步骤（5）。•根据280nm峰值合并蛋白峰，对PBS透析，PEG浓缩，-20度保存。蛋白质纯化系统单克隆抗体的制备•单克隆抗体的定义：序列、结构、功能、抗原结合性质都完全相同的抗体。•来源：杂交瘤细胞表面展示抗体文库单一B细胞单克隆抗体来源的图示骨髓瘤细胞SP2/01.HGPRT基因缺陷2.TK基因缺陷3.不分泌抗体细胞融合的方法•病毒介导的细胞融合•PEG介导的细胞融合•电融合HAT培养基在杂交瘤细胞筛选中的作用•HAT选择培养基的作用是筛选出（杂交瘤细胞）。HAT选择培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成不能发生。用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。单克隆的筛选•液体有限稀释法（细胞计数）•半固体培养基法单克隆抗体的鉴定•ELISA方法的原理：•包被抗原•加入培养基•酶标二抗小鼠单克隆抗体的制备•杂交瘤细胞的体外培养：RPMI1640培养基产量较低，条件要求比较严格，可以放大。•小鼠腹水的生产方法：1）腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml。2）7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。3）间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；4）将腹水离心（2000r/min5分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。噬菌体抗体库Surfacedisplayantibodylibrary噬菌体展示库Phagedisplaylib