单克隆抗体的制备实验

CasparGu2011-4-12目录实验目的实验原理实验材料实验步骤注意事项一、实验目的a.了解并掌握单克隆抗体的制备原理；b.熟悉单克隆抗体的制备过程；c.熟练掌握无菌操作技术。二、实验原理1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。发展历史一般的单克隆抗体制备方法大同小异。都包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产这一系列实验步骤。常用方法1.单一特异性，与一个抗原决定簇反应；2.可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；3.一经制出，可无限量地供应；4.生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；5.能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。优点三、实验材料1仪器设备2手术器具超净工作台、恒温培养箱、超低温冰箱、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。剪刀、镊子、解剖板、平皿（直径为10cm），15ml/50ml一次性离心管，50ml玻璃融合管200目不锈钢细胞筛，玻璃注射器针芯，10ml玻璃注射器（9号针头）4试验动物ICR小鼠1只，BALB/c小鼠1只3实验试剂PEG1500，无血无抗RPMI1640培养基，HT/HAT培养基（含10%FBS/CBS，工作浓度HT/HAT的RPMI1640培养基）5Sp2/0细胞融合前一周复苏，第二天换液，长满后传代，融合前一天换液。一次融合需2~3瓶（75m2）Sp2/0细胞。四、实验步骤(1)1.取饲养细胞取一只SPF级6-8周龄ICR小鼠，断颈处死，置75%乙醇中消毒5min↓取一只10ml玻璃注射器，吸入7~8ml含10%FBS、HAT的RPMI1640培养基，剪开皮肤、沿切口上下撕开皮肤，充分暴露腹部，换镊子，拎起腹膜，沿腹部中线偏左下方进针，针头不要进入内脏器官，取一个干净的酒精棉球轻轻挤压小鼠腹部，同时反复吹打注射器，反复3-5次，待培养基变黄后将其转移到80mlHAT培养基中，备用。2.取免疫小鼠脾脏免疫小鼠摘眼球取血后断颈处死，置75%乙醇中消毒5min↓将高压过的细胞晒放到平皿中，细胞晒中加入10ml左右的无血清1640，小鼠左侧卧位，剪开皮肤，沿切口上下撕开皮肤，可以看到脾脏所在位置；换剪刀、镊子，剪开腹膜，充分暴露脾脏；换剪刀、镊子，镊子轻轻夹住脾脏，用剪刀分离脾脏，尽量不要带结缔组织，将脾脏放入钢网中，用无菌的针头戳几下，用玻璃针芯轻轻挤压脾脏直至仅剩包膜，用几毫升无血清1640冲洗针芯和细胞晒，将滤液置于50ml离心管中，备用。3.收集Sp2/0细胞取已长满的Sp2/0细胞2~3瓶，用弯头尖吸管将细胞吹下来，置于50ml离心管中，原瓶补液继续培养↓4.清洗脾细胞和Sp2/0细胞800rpm，离心5min↓弃上清，轻轻磕几下50ml离心管底部（使细胞团块松散），加入两吸管无血清1640，轻轻吹打均匀，补培养液至20ml↓脾细胞和Sp2/0细胞，800rpm，离心5min↓5.融合将PEG1500置于37℃水浴锅上，熔化后，加入0.5ml无血清1640，混匀，即为50%PEG↓取离心好的脾细胞和Sp2/0细胞，弃上清（注意保持这个姿势）用滤纸条轻轻沾去管壁上的培养液（保证PEG不被稀释）。将离心管放到37℃水浴中（用一小烧杯制备水浴），1min加入PEG（边加边搅），搅30sec；静止1min。四、实验步骤(2)四、实验步骤(3)6.终止将一吸管无血清培养液在1min内加入细胞中，动作尽量轻柔，边加边搅。（此时，细胞在PEG作用下已变形皱缩，加液太快，动作过粗，会引起细胞破裂死亡。）随后，不用计时，但仍要慢慢滴加培养液，最后补液至20ml。↓800rpm，离心5min↓7.铺板弃上清，细胞团块溶于100mlHAT培养液（前面已经准备好的）内，充分混匀后，铺板5-7块。置于37℃，5%CO2培养箱,第二天检查是否污染，第五天计算融合率，第七天换液（一定要沿孔壁把原孔液体吸干净），第十天检测。五.注意事项1.无菌操作：单克隆抗体的制备过程需要严格无菌，包括使用的器械、试剂等均需要无菌处理，注意实验操作中的无菌操作;2.用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物;3.抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性;4.融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格；浓度越高，对细胞的毒性越大。