宫颈液基细胞学制片技术与镜下诊断(新)

宫颈液基细胞学制片技术与镜下观察彭振武[e-mail]广州安必平医药科技股份有限公司主要内容液基细胞学常见制片技术液基细胞学染色方法常见质量问题与镜下形态宫颈液基细胞学质量控制4123（一）液基细胞学常见制片技术•1.膜式技术•2.沉降式技术•3.离心甩片技术•4.手工制片技术•5.其他膜式技术•最早出现的液基细胞学制片技术•原理—膜式负压过滤•代表产品：TCT膜式技术制片原理•宫颈脱落细胞中常见的成分：•黏液，血液，炎性细胞，上皮细胞，肿瘤细胞•过滤膜孔径8um,黏液，红细胞及部分直径较小的炎性细胞能穿透，而上皮细胞及肿瘤细胞则被“卡”在过滤膜上，从而达到去除杂质，收集有效诊断细胞成分的目的。•膜孔阻塞会造成细胞成团•细胞通透力度大小不一，中间视野细胞偏少，周边视野细胞量聚集•细胞团被外力压扁，腺细胞团特有的三维立体结构消失膜式技术对制片的影响•自动化程度最高的制片技术•原理—分离提取；自然沉降•代表产品：LCT,LBP沉降式制片技术•原理一：密度分层去除杂质•宫颈脱落细胞中常见的成分：•黏液，血液，炎性细胞，上皮细胞，肿瘤细胞•分离提取液（密度液）比重较保存液大，细胞沉降到达两者交界处，只有自身比重大，能克服下层分离液阻力的细胞才能继续下降，从而被收集。样本中的粘液，红细胞比重轻，无法透过分离提取液，被分层在上部，继而被去除；上皮细胞，肿瘤细胞及部分炎性细胞则被收集用来制片。沉降式技术制片原理LCTLBP•原理二：重力自然沉降，优先富集有效诊断细胞•细胞自然沉降，与玻片相吸附，没有外力施压，某些成团的细胞保持三维立体结构，一方面对判读来源有帮助，另一方面，镜下细胞不在同一层面上，需要调节微调才能观察清楚沉降式技术对制片的影响（二）液基细胞学染色方法•《细胞病理学技术制作规范及质量控制》：•宫颈细胞学制片需采用巴氏染色•非宫颈细胞学制片可以采用巴氏，HE染色•宫颈细胞学质控要求采用巴氏染色的原因。•1：巴氏染色是国际通行的染色方法。•2.HE染色不能显示鳞状细胞的分化层次，不利于直观的感受激素水平，不利于判断细胞的组织学层次来源。•3.HE染色不能显示胞浆不同的色彩，对于感染性病变，放疗引起的改变等失去了提示意义。•4.HE染色核染色质容易凝集造成深染，失去核的细微结构，容易造成过诊断。•通过巴氏染色，表层角化细胞胞浆呈现红色，中层呈蓝色，底层呈蓝绿色；这一特点可以用来判断雌激素水平的高低，同时也能对我们的诊断带来帮助。•小的细胞本应该呈现蓝绿色，但是当胞浆呈红色，核有异型时，提示鳞状上皮病变可能性大。•=310086•年龄：40岁•判读结果：HSIL•巴氏染色能更加清楚的表达核的信息。细胞学的诊断关键还是在于核的异型性改变，核膜，核染色质，核仁等信息的表达清楚与否事关重要。•=311018•年龄：34岁•判读意见：HSIL•巴氏染色能好的显示胞浆的色彩变化，常见的有：角化不全嗜橘黄改变，病原微生物感染嗜双色改变，放疗反应呈多彩性改变•=213598•判读意见：滴虫（巴氏染色）•=215119•判读意见：滴虫（HE染色）•=253767•判读意见：放疗反应性改变•巴氏染色能使细胞，特别是肿瘤细胞有更鲜明的核浆对比效果。HE染色的肿瘤细胞往往染色较深，很难观察清楚。•=108&keyno=300995&pageno=1•年龄：35岁•活检结果：宫颈管腺癌•个人体会：•巴氏染色对于肿瘤细胞的着色，相比于HE染色，显得“温和很多”，一般不会出现细胞核完全染成看不清楚结构的现象。•腺细胞，或成团细胞，着色能力更加强，巴氏染色对这些细胞的观察更加清楚。（三）液基细胞学制片常见问题与镜下形态•常见问题•1.细胞量•2.细胞分布•3.细胞染色•4.细胞清晰度•5.污染•1.标本满意度评估，是否属于不满意标准？•2.出现的问题是属于个别现象还是整体现象？•3.整体现象从哪几方面检查？细胞量过少解决思路：•液基制片：至少应有5000个形态清晰完整的鳞状上皮细胞。•大致判断标准：400倍镜下，每个视野大于4个（膜式），大于8个（沉降式）。•强调说明：1.计数的为鳞状细胞，鳞化细胞也可以算。2.计数的为一张制片，而不是几张制片的总和。3.最低计数标准适用于宫颈细胞学样本，对于子宫全切术后，阴道取样标本不适合。4.任何存在异常细胞的样本均属于合格样本。标本满意度的评估•细胞量少，整体出现时考虑以下因素•1.取样环节：取样刷过软，取样医生用力过小•2.制片操作环节：抽吸力度过大，转移样本量过少，玻片吸附力差•1.细胞量过多的表现有哪些？•2.出现的是个别现象还是整体现象？•3.出现的为整体现象时要考虑哪些因素？细胞量过多解决思路：•细胞量整体过多时要考虑以下因素：•1.吸附力影响•2.转移标本量过多•3.振荡不充分•1.个别现象还是整体现象？•2.个别现象考虑什么原因？整体现象考虑什么原因？细胞分布不均匀解决思路•个别制片细胞分布不均•1.标本自身原因：粘液，血液过多•2.玻片吸附力不稳定•整体制片细胞分布不均匀•1.玻片吸附力低•2.技术自身缺陷•1.个别现象还是整体现象？•2.染色深了还是染色浅了？•3.细胞核还是细胞浆的染色问题?•4.影响染色的因素有哪些？染色问题解决思路•巴氏染色的几点基本常识：•1.染色原理：物理作用，化学作用。•2.染料分类：碱性染料，酸性染料。•巴氏染色相关的影响因素•1.时间•2.温度•3.PH值•4.固定是否及时•5.脱水是否干净•PH值•当染色效果通过调节时间长短，考虑了温度变化后，仍然不能获得满意效果。需要考虑染液自身或者次缓冲液的PH值。•在碱性环境下苏木素容易着色，伊红，亮绿，橘黄不容易着色；反之亦然。•固定不及时•核染色质信息表达不清晰，胞浆透明效果差。•脱水不干净•酒精不纯或湿度大：影响胞浆上色，片子整体呈现绿色或者灰色。•二甲苯进水：整片细胞颜色单一，不鲜艳，常可见背景中有小水珠。（50）（51）•干燥现象•表现：鳞状上皮细胞胞浆里出现深褐色斑点•原因：片子染色完成后，封片以前在空气中暴露时间过久所致（54）•干封（不过二甲苯）：对于成熟的鳞状上皮影响较小，但是对于底层的鳞状上皮及腺细胞，间皮细胞影响很大；对于单个散在的细胞影响较小，对于成团的细胞影响很大。（56）（58）胸水（59）胸水•封片胶：多种环保胶都会影响液基制片的最终效果，比如褪色，模糊，轻微干燥现象等。（60）（61）（62）•1.制片过程中的交叉污染•2.外源性污染污染如何鉴别制片污染•如果不注意制片环境及操作流程，制片中经常会见到污染成分。特别是一些形态与念珠菌类似的污染菌，往往会影响到我们的判读结果，可以从以下几个方面加以鉴别：•1.，看整体：污染菌常漂浮在片子中，或者是单独出现背景中，多的时候彼此缠绕如杂草一般。念珠菌感染则常常串起在鳞状上皮团之间。•2，看反应性改变：污染菌不引起细胞的增生，也不引起细胞的虫蛀样改变及嗜双色改变。念珠菌感染可以引起鳞状上皮的普遍性增生，有较明显的反应性改变。•3，看具体形态：污染菌染色常较浅，多为灰红色或蓝绿色，念珠菌为红色；污染菌无竹节状典型特征，多为面条状或串珠状；污染菌的芽孢不如念珠菌典型，或没有。•4，看出现概率（很简单也很重要）：一批制片中如果出现菌丝的比例过高（个人觉得超过30%），首先要考虑污染。如何解决制片污染•1，彻底清洗机器管道•2，检查载玻片，盖玻片是否清洁•3，更换自配的试剂，特别要注意清洗试剂瓶，污染菌往往长在瓶壁与瓶底•4，实验室环境差的话，建议安装紫外线灯交流，讨论•在宫颈液基细胞学制片中，有些少见的东西，见过一次就不会再忘记，问题是当它初次出现的时候，我们认识它吗？•=298540•=293946•=207890•判读意见：吴策线虫属班氏丝虫型微丝蚴•=207888•判读意见：蛲虫卵•=108&keyno=283637&pageno=1•判读意见：镰刀菌•=16654•判读意见：链格孢菌属•=19581•单细胞藻类（四）液基细胞学制片质量控制•好的液基细胞学制片取决于质量优异的液基细胞学制片产品，取决于责任心强的液基细胞学制片技术员，取决于懂得制片技术的细胞病理诊断医生对质量的控制。•网络上很多争论激烈的帖子，其实是由于制片效果不好，细胞形态观察不清楚所造成的。•实际工作中很多误诊，漏诊的病例，也是由于制片效果不好，细胞形态观察不清楚所造成。•只有成团细胞观察清楚的片子才是合格的液基制片。•只有细胞核信息表达清晰的细胞才是有诊断价值的细胞。•个人体会•细胞病理诊断医生，掌握以下两个问题，能解决绝大部分制片质量问题。•1.成团的东西是什么？•2.成团的东西怎么才能看清楚?这样的片子您有把握诊断吗？病例讨论•制片存在哪些质量问题？•1.细胞量过多•2.染色过深•3.杂质（粘液）去除不干净•4.成团细胞观察不清楚•病例讨论结果•第一次制片判读意见：HSIL•第二次制片判读意见：HSV•病理诊断中最大的陷阱是人为造成的。•病理诊断医生重视制片质量问题，是对自己的保护。•成团的细胞（高核浆比的细胞）如何才能看清楚？•更换次缓冲液（注意是否失效，注意PH值）•避免干封总结•一张好的液基制片，取决于优良的液基细胞学产品，取决于制片过程中各个环节的控制，取决于技术员和细胞病理诊断医生的责任心。•冒着风险去做诊断，就有可能昧着良心去发报告。•技术是诊断的前提，技术需要更多病理诊断医生的参与和质量控制。（104）谢谢！